噬菌体质粒携带新型甲氧苄啶耐药基因dfrA50和dfrA51的发现及其传播机制研究

这篇研究揭示了噬菌体质粒（phage-plasmids）作为新型抗生素耐药基因（ARGs）传播载体的重要作用，首次鉴定出两个功能性甲氧苄啶耐药基因dfrA50和dfrA51，并通过结构功能分析和流行病学调查证实其通过噬菌体感染和质粒接合双重途径在病原菌中广泛传播，为耐药性监测提供了新靶点。

　　

噬菌体质粒携带新型耐药基因的发现与功能解析

ABSTRACT
噬菌体质粒（phage-plasmids）作为兼具噬菌体和质粒特征的杂交遗传元件，携带大量临床相关抗生素耐药基因（ARGs）。研究团队通过隐马尔可夫模型（HMMs）和BLASTn比对，从12,443个噬菌体基因组中筛选出46个具有质粒特征的噬菌体，其中6个携带7个ARGs。值得注意的是，半数噬菌体携带甲氧苄啶耐药基因dfrA类似物，功能研究证实dfrA50和dfrA51能在大肠杆菌中赋予甲氧苄啶耐药性。基因组分析显示这些噬菌体质粒可能通过自然传播将dfrA基因扩散至多种致病菌质粒中。

INTRODUCTION
细菌耐药性（AMR）已成为全球公共卫生危机，2019年直接导致127万人死亡。水平基因转移（HGT）是AMR产生的主因，而噬菌体质粒作为新型移动遗传元件，可通过裂解转换和接合转移双向传播ARGs。甲氧苄啶作为WHO推荐的四线抗生素，其耐药主要由dfrA基因介导。研究首次系统评估了具有质粒特征的噬菌体基因组中ARGs的多样性。

RESULTS AND DISCUSSION
Phages exhibiting plasmid features carry novel ARGs
通过宽松阈值搜索策略，在46个噬菌体质粒中发现7个ARGs，包括2个已知基因（bla_TEM-1
和bla_CTX-M-27
）和5个新基因。基因图谱显示这些ARGs多与转座酶基因相邻，但dfrA50和dfrA51周围未发现移动元件。

Expression of novel dfrA genes
功能实验显示，dfrA50和dfrA51在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的甲氧苄啶MIC值分别为512 mg/L和256 mg/L，虽低于阳性对照dfrA49（2048 mg/L），但显著高于空白对照。AlphaFold 3预测显示三者结构保守（RMSD<0.7?），但分子对接发现结合位点差异：DfrA50/51的关键残基为A6/I13/S48，而DfrA49为D20/S50/N47/Y107。ITC测定显示DfrA51与甲氧苄啶结合解离常数（K_d
）为6.41×10^?6
M，介于DfrA49（3.29×10^?5
M）和EcDHFR（7.30×10^?7
M）之间。

Phylogenetic analysis
进化树显示DfrA50/51形成独立分支，与已知DfrA同源性<50%，提示其独特进化起源。

Natural dissemination of dfrA genes
基因组比对发现：

1. 携带dfrA50的肺炎克雷伯菌噬菌体质粒ST13-OXA48phi12.3与临床分离株质粒相似度>96%
2. 携带dfrA51的沙门氏菌噬菌体质粒SSU5在肠杆菌属、柠檬酸杆菌属质粒中广泛存在
   值得注意的是，这些噬菌体质粒缺乏接合转移基因，暗示存在未知传播机制。

MATERIALS AND METHODS
研究采用HMMs筛选噬菌体质粒，通过SOE-PCR构建表达载体，使用AutoDock 1.5.7进行分子对接，ITC测定蛋白-药物相互作用。突变实验证实A6V/I13A/S48A突变会显著降低耐药性（4-32倍）。

CONCLUSIONS
该研究首次揭示噬菌体质粒携带的新型dfrA基因可通过双重传播机制在病原菌中扩散，其独特的结构特征和传播途径为耐药性防控提供了新视角。建议加强对这类杂交元件携带ARGs的监测，以应对潜在的公共卫生威胁。