基于重组工程的高通量大肠杆菌基因组编辑平台GIDGE的开发与应用

本文推荐一种创新的基因组编辑方法GIDGE（Guide sequence-Independent and donor DNA mediated Genomic Editing），通过优化线性供体DNA的磷酸硫代（PT）修饰和CRISPR系统整合，实现了大肠杆菌（E. coli）的高效、无痕编辑。该方法支持96孔板并行操作，可完成基因删除（Δ）、插入、替换和点突变，尤其在野生型菌株MG1655和益生菌株Nissle 1917中表现突出，为微生物工程自动化提供了重要工具。

　　

摘要

随着微生物学领域对高效、高通量基因组编辑技术的需求增长，本研究开发了基于重组工程（recombineering）的GIDGE方法。通过优化供体DNA的磷酸硫代（PT）修饰和同源臂（HA）长度，将化学转化效率提升2-3个数量级，并结合CRISPR/Cas9系统实现无痕编辑。该方法在常见大肠杆菌（如JM109、DH10B）和野生型菌株（如MG1655、Nissle 1917）中均展现出高效性，尤其适用于大规模基因库构建。

引言

细菌基因功能研究依赖于基因敲除技术，但传统方法如自杀质粒或Red重组工程存在效率低、需多次转化等问题。CRISPR技术虽广泛应用，但仍受限于向导RNA（gRNA）设计和质粒构建的复杂性。本研究旨在开发一种不依赖质粒构建、可高通量操作的编辑平台。

结果

供体DNA结构优化

通过设计10种不同结构的供体DNA（如单/双链、平/粘末端），发现5′端含4个连续PT修饰的双链DNA（dsDNA）结合400 bp同源臂时，重组效率最高（6,370 RFU/μg DNA），较未修饰DNA提升19.4倍。T7核酸酶消化实验证实，滞后链在重组中起关键作用。

GIDGE方法建立

将优化后的重组系统与CRISPR/Cas9结合，构建了载体p15A-Red-Cas9-sgRNA。通过两步同源重组：第一步插入含Amp^r
和预设计靶位点（N20-PAM）的供体DNA；第二步由Cas9诱导双链断裂（DSB）触发二次重组，实现目标序列的无痕删除。

大片段删除验证

在MG1655中成功删除1-80 kb的连续片段及多个非连续大片段（14.3-143.9 kb），编辑效率不受长度影响。EcN菌株中，PT修饰使22.4 kb片段删除效率提升显著，证实该方法在非模式菌株中的适用性。

高通量应用

通过96孔板并行操作，一次性构建了96个单基因敲除突变体和65个大片段删除库。删除基因覆盖59.67%的基因组，功能涉及碳水化合物代谢（G类）、氨基酸转运（E类）等COG分类。

讨论

GIDGE方法突破了传统CRISPR对gRNA设计的依赖，且避免了质粒构建的繁琐步骤。PT修饰显著提升了化学转化效率，使编辑周期缩短至3n+2天。局限性在于无法编辑必需基因，但通过大片段删除库筛选，已应用于氨基酸生产（如色氨酸合成酶trpE^fbr
突变）和质粒稳定性优化等场景。

材料与方法

实验使用DH5α、JM109等菌株，LB/SOB培养基培养。供体DNA通过PCR从pUC19-N20或pR6K19-N20模板扩增，PT修饰由定制引物引入。重组测试采用pKD46-tet载体，编辑验证通过PCR和测序完成。高通量操作全程在96孔板中完成，结合蔗糖反选（sacB系统）去除质粒。

结论

GIDGE平台为大肠杆菌基因组工程提供了高效、可扩展的解决方案，尤其适用于生物铸造厂（biofoundry）的自动化需求。未来可拓展至其他原核生物，推动合成生物学和工业微生物的快速发展。