土壤细菌Cupriavidus necator H16挥发性脂肪酸代谢的遗传决定因素解析及其生物技术应用潜力

这篇研究深入解析了土壤细菌Cupriavidus necator H16代谢挥发性脂肪酸（VFAs）的遗传机制，通过转录组学、生化分析和基因敲除实验，揭示了关键基因簇H16_B1332-H16_B1337在己酸（C6）代谢中的核心作用。研究发现该菌通过特异性调控TCA循环、甲基柠檬酸循环（methylcitrate cycle）和β-氧化（β-oxidation）通路实现VFAs高效利用，为利用废弃物衍生碳源开发生物工艺提供了新思路。

　　

ABSTRACT
土壤细菌Cupriavidus necator H16是一种极具潜力的宿主，可将废弃物衍生的挥发性脂肪酸（VFAs）升级为可再生生化产品。尽管细菌VFA代谢途径已被广泛研究，但C. necator基因组编码了多个同源酶，其底物特异性尚不明确。通过转录组学分析发现，该菌在乙酸（C2）、丙酸（C3）、丁酸（C4）、戊酸（C5）和己酸（C6）作为唯一碳源时，显著上调了与底物激活和β-氧化相关的基因簇。进一步生化实验证实，酰基辅酶A合成酶（ACS）H16_B1335对己酸代谢至关重要，其所在基因簇H16_B1332-H16_B1337的缺失会导致显著的生长延迟。

INTRODUCTION
生物经济的关键在于利用废弃物衍生碳底物进行生物升级。C. necator因其代谢多样性和工业应用潜力成为理想宿主。VFAs作为可持续原料，可通过电化学还原CO₂
或厌氧消化废弃物获得。然而，VFAs的毒性和代谢效率限制了其应用。本研究旨在揭示C. necator中VFA代谢的调控机制，为代谢工程提供理论基础。

RESULTS
RNA测序揭示VFA代谢特征
转录组数据显示，TCA循环和甲基柠檬酸循环基因在偶数链和奇数链VFAs中分别特异性上调。例如，丙酸和戊酸（C3/C5）显著激活甲基柠檬酸循环基因，而乙酸、丁酸和己酸（C2/C4/C6）优先诱导乙醛酸分流途径。

ACS酶的底物特异性
体外酶活实验表明，五种ACS酶（如H16_B1148和H16_B1335）对C3-C5底物活性最高，其中H16_B1335对己酸表现出独特偏好性。基因敲除实验进一步证实，仅H16_B1335缺失会显著延缓己酸条件下的生长，而其他ACS酶的冗余功能可补偿底物代谢缺陷。

基因簇H16_B1332-H16_B1337的功能解析
该簇包含ACS（H16_B1335）、酰基辅酶A脱氢酶（H16_B1332）和短链脱氢酶（H16_B1334）基因。研究发现：

• H16_B1334缺失在野生型背景（CHC123）中导致严重生长延迟，暗示3-OH-酰基脱氢步骤可能是限速环节。
• 相邻转录因子H16_B1342通过正调控该簇表达参与己酸代谢适应。
• 组成型表达该簇基因未能提升己酸生长速率，表明氧化还原平衡或运输毒性等其他因素可能成为瓶颈。

DISCUSSION
研究揭示了C. necator通过精细调控代谢网络实现VFA高效利用的机制。基因簇H16_B1332-H16_B1337的发现为定向改造菌株提供了新靶点，但其应用仍需解决 redox平衡和毒性等问题。该工作不仅深化了对微生物代谢冗余的理解，也为开发基于废弃物VFAs的生物制造工艺奠定了科学基础。

MATERIALS AND METHODS
实验采用RNA测序、qRT-PCR验证、基因敲除和回补策略，结合体外酶活测定（监测NADH消耗的偶联反应）系统解析代谢机制。所有菌株均在ATCC 550培养基中培养，生长曲线通过Bioscreen C Pro微孔板分析仪动态监测。