重组抗性减毒活疫苗候选株RMTv1-nsp1+nsp15的构建及其对猪流行性腹泻病毒的免疫保护作用

这篇研究通过反向遗传学技术构建了重组抗性猪流行性腹泻病毒（PEDV）减毒活疫苗（LAV）平台RMTv1，并通过靶向干扰素拮抗蛋白nsp1和nsp15的联合突变（N93/95A+H226A）进一步优化。该候选疫苗在仔猪模型中展现出显著安全性（零死亡率）和完全保护效力（100%抵抗强毒株攻击），其核心创新点包括：1）重编程转录调控序列（TRS-CS）阻断与野毒株重组；2）双位点衰减突变降低毒力回复风险；3）增强干扰素（IFN）诱导能力。研究为冠状病毒疫苗开发提供了兼顾安全性与有效性的新策略。

　　

ABSTRACT
猪流行性腹泻病毒（PEDV）是导致新生仔猪高死亡率的重要冠状病毒，现有疫苗难以有效防控。本研究基于前期构建的重组抗性突变株RMT，通过修正其E基因TRS-CS上游189-nt插入和N基因TRS-CS的G缺失，开发出优化疫苗骨架RMTv1。进一步在该骨架上引入干扰素拮抗蛋白nsp1（N93/95A）、nsp15（H226A）和nsp16（D129A）的单/双突变，系统评估了六种变异株的复制效率、IFN敏感性及遗传稳定性。

INTRODUCTION
PEDV自2013年在美国暴发以来，已造成全球养猪业数十亿美元损失。当前农场采用感染猪肠道反馈物免疫孕母猪的方法存在传播其他病原体的风险。减毒活疫苗（LAV）虽能诱导黏膜免疫，但存在毒力回复和与野毒株重组的风险。研究团队此前通过重编程TRS核心序列（TRS-CS）构建了重组抗性株RMT，但其携带非设计突变。本研究旨在优化该平台并联合干扰素通路衰减策略。

RESULTS
疫苗骨架与突变株构建
RMTv1在Vero细胞中成功拯救，其基因组稳定性经10代传代验证。引入的nsp1/nsp15双突变株（RMTv1-nsp1 + nsp15）在LLC-PK1细胞中表现出复制减弱（峰值滴度8.28 log₁₀
拷贝/mL）和IFN-β敏感性增强（100 U/mL处理时病毒滴度不可测）。

免疫诱导与复制特性
TRS-CS重编程显著提升IFN-λ1/3表达（较亲本株高3-5倍）。有趣的是，所有突变株在5′-UTR非设计区自发产生补偿性突变（如g73a），其位置越接近TRS-CS（67-72 nt），对病毒复制的促进作用越强。RMTv1-nsp1 + nsp15的a76缺失虽未完全抵消IFN诱导增强效应，但使临床衰减更显著。

仔猪攻毒保护
在3日龄无菌仔猪中，RMTv1-nsp1 + nsp15接种组实现：

1. 零死亡率（vs 亲本株75%死亡率）
2. 无严重腹泻（粪便评分<2）
3. 攻毒后病毒RNA排泄量降低10⁵
   倍
4. 中和抗体效价提升8倍（21 dpi时达1:128）

DISCUSSION
该研究创新性体现在三方面：

1. 重组阻断机制：改造后的TRS-CS与野毒株转录机制不兼容，通过破坏亚基因组RNA（sgRNA）合成阻断重组病毒产生。
2. 双轨衰减策略：TRS重编程增加缺陷RNA生成（作为PAMP激活免疫），而nsp1/nsp15突变协同削弱病毒免疫逃逸。
3. 临床转化潜力：RMTv1-nsp1 + nsp15在保持免疫原性同时，其安全性满足母猪免疫要求，为替代现行反馈物疗法提供可能。

MATERIALS AND METHODS
关键技术包括：

• 基于T7聚合酶的全基因组拯救系统
• 空斑纯化结合高通量纳米孔测序监控遗传稳定性
• 仔猪攻毒模型采用6 log₁₀
  TCID₅₀
  超高剂量模拟田间感染压力

该研究为冠状病毒疫苗开发提供了可推广的技术范式，其TRS重编程策略亦可应用于SARS-CoV-2等其他Nidovirus疫苗设计。