SARS-CoV-2核衣壳蛋白趋同进化促进人类感染的适应性突变研究

这篇研究揭示了SARS-CoV-2核衣壳蛋白（N蛋白）203-205位点的趋同进化突变（R203K+G204R/KR、R203M、T205I）如何通过差异化调控磷酸化模式增强病毒在人类细胞中的复制与致病性，同时削弱其在蝙蝠细胞中的适应性。研究结合反向遗传学（reverse genetics）、磷酸化亲和电泳（PA SDS-PAGE）和仓鼠模型，阐明这些突变通过改变N蛋白丝氨酸-精氨酸（SR）结构域的磷酸化状态，驱动病毒对人类宿主的特异性适应，为未来人畜共患病冠状病毒的跨物种传播机制提供关键见解。

　　

SARS-CoV-2核衣壳蛋白的趋同进化与宿主适应性

ABSTRACT
COVID-19大流行早期，多个关切变异株（VOC）在核衣壳（N）蛋白203-205位点独立获得突变：Alpha/Gamma/Omicron携带R203K+G204R（KR），Delta含R203M，Beta含T205I。前期研究证实KR突变通过增强N蛋白磷酸化提升病毒适应性和致病力。本研究系统比较这三种突变对人类和蝙蝠细胞的差异化影响，揭示其作为趋同进化事件驱动人类感染适应的分子机制。

INTRODUCTION
SARS-CoV-2的持续进化产生具有不同突变谱的VOC，其中N蛋白SR结构域（含丝氨酸/精氨酸富集区）的203-205位点突变尤为突出。尽管既往研究聚焦刺突蛋白（S）突变，但N蛋白作为病毒RNA包装和免疫逃逸的关键元件，其突变可能通过调控磷酸化状态影响病毒生命周期。

RESULTS

变异株SR结构域突变增强病毒复制
通过反向遗传学将KR、R203M、T205I突变引入华盛顿-1（WA-1）株发现：在人类呼吸道上皮细胞（Calu-3 2b4）中，所有突变株24小时病毒滴度均显著高于野生型（WT），其中KR和R203M的增强效应持续至48小时。而在非洲绿猴肾细胞（Vero E6）中，仅KR和R203M显示早期复制优势，提示宿主细胞特异性。

SR突变株的适应性竞争呈现细胞类型依赖性
直接竞争实验揭示：在Calu-3细胞中T205I突变株最具竞争优势，KR次之；但在Vero细胞中R203M占据主导。值得注意的是，KR突变赋予对I型干扰素（IFNα）的部分抵抗能力，而其他突变无此特性，这可能是其最终在流行株中占据主导的原因之一。

R203M和T205I突变增强体内感染
仓鼠模型显示：与WT相比，R203M和T205I突变株在肺组织中病毒载量提高2-10倍，且病理评分显著升高（肺泡出血、血管周围炎症加重）。但不同于KR突变，二者未引起更显著的体重下降。免疫组化显示R203M突变株的N蛋白抗原分布更广泛，而T205I则呈现局灶性高复制特征。

不同SR突变诱导独特的磷酸化模式
磷酸化亲和电泳（Phos-tag SDS-PAGE）揭示：KR突变产生多梯度的磷酸化条带，R203M呈现单条主带伴微弱中间带，T205I则形成高磷酸化条带。尽管磷酸化比例无统计学差异，但各突变株的磷酸化位点分布模式显著不同，其中仅KR突变显著提升病毒全基因组（FL）和亚基因组（sg）RNA转录水平。

SR突变在蝙蝠细胞中表现相反效应
在表达人ACE2的大棕蝠肾细胞（Efk3B-hACE2）中，R203M和T205I突变株的复制能力较WT降低10-100倍，且N蛋白磷酸化水平普遍下降。KR突变株虽维持与WT相当的滴度，但失去人类细胞中的复制优势。这与Sarbecovirus自然宿主中203-205位点的高度保守性形成鲜明对比，印证这些突变是人类适应性进化的结果。

DISCUSSION
研究首次系统比较三种N蛋白SR结构域突变的功能差异：

1. 分子机制：突变可能通过改变GSK-3激酶对Ser206"启动磷酸化"的识别，进而影响下游Thr198/Ser194的磷酸化级联；
2. 流行病学意义：T205I在人类呼吸细胞中竞争优势最强，但Delta（R203M）的流行可能与其增强上呼吸道感染能力有关；
3. 跨物种传播：N蛋白磷酸化模式的宿主特异性差异为冠状病毒宿主限制性屏障提供新解释。

MATERIALS AND METHODS
关键技术包括：基于WA-1株的反向遗传学系统、磷酸化特异性抗体（p-Ser202）、Tiled-ClickSeq测序技术，以及使用SV40大T抗原永生化的大棕蝠肾细胞模型。仓鼠实验采用3-4周龄雄性叙利亚金仓鼠，通过鼻内接种10⁴
FFU病毒评估肺部病理。

ACKNOWLEDGMENTS
研究受美国国立卫生研究院（NIAID R01-AI153602）和德克萨斯大学系统STARs奖资助，关键试剂由合作者Jacob Nilsson博士提供的磷酸化抗体支持。