荧光标记技术：细菌拮抗作用的高效监测新策略

（编辑推荐）本研究开发了一种基于荧光标记（RFP）的细菌拮抗作用快速筛查方法，通过荧光强度（RFU）与菌落形成单位（CFU）的强相关性验证，解决了传统选择性培养基（如CFU计数）耗时、低通量的局限。该方法适用于革兰阳性（如金黄色葡萄球菌SA）和阴性菌（如大肠杆菌EC），为微生物群落互作研究提供了半定量、半高通量的新工具。

　　

荧光标记技术揭示细菌战争的隐秘动态

ABSTRACT
细菌在资源有限的微生物群落中演化出多种抗菌武器。本研究利用红色荧光蛋白（RFP）标记的革兰阳性菌金黄色葡萄球菌（SA，表达DsRed）和革兰阴性菌大肠杆菌（EC，表达mCherry），与铜绿假单胞菌（PA/PDO）和嗜麦芽窄食单胞菌（SM）竞争，建立了一种通过相对荧光单位（RFU）快速评估拮抗作用的新方法。

RESULTS
荧光信号的绝对优势
SA和EC的RFU值显著高于竞争者（P<0.0001），其中SA荧光强度达EC的6倍，源于质粒拷贝数或启动子差异。

生长与荧光的完美同步
在液体培养中，SA的OD₆₀₀
与DsRed荧光（r²
=0.95）、EC的OD₆₀₀
与mCherry（r²
=0.96）均呈现极强相关性，尽管荧光产生存在滞后效应。

竞争结果的荧光解码
1:1共培养24小时后，PA使SA的CFU和RFU降低10⁴
倍（P<0.0001），SM对EC的抑制同样显著。在液体TSB培养基中，PA使SA的RFU增长提前停滞，验证了方法的跨介质适用性。

比例与密度的灵活适配
即使调整起始OD₆₀₀
（0.05或1）和菌种比例（1:10至10:1），RFU下降始终与CFU减少一致，但EC在10:1高密度竞争时出现统计学波动。

DISCUSSION
该技术突破传统CFU计数5-7天的周期，可在24小时内完成筛查。其优势在于：

1. 无需特定抗生素选择压力，规避耐药性交叉干扰；
2. 兼容固体/液体培养体系；
3. 可扩展至多菌种互作研究。

局限性包括荧光延迟现象和终点法的定量精度不足。未来可通过多色荧光标记（如GFP+RFP）实现双向互作追踪，或结合实时监测提升动态解析能力。

MATERIALS AND METHODS
实验采用pHC48（sarA P1启动子，氯霉素抗性）和pUC20T（lacZ启动子，羧苄青霉素抗性）质粒。荧光检测参数：DsRed（554/586 nm）、mCherry（587/610 nm），增益统一设定为100。统计采用GraphPad Prism 9进行ANOVA和Welch校正检验。

ACKNOWLEDGMENTS
研究受NIH（AI139188/AI158452）和美国疾控中心（CK22-2204）资助，凸显其在感染性疾病（如囊性纤维化肺部感染）研究中的转化价值。