肺炎克雷伯菌荚膜抗原抗体功能评估：功能性调理吞噬试验的开发与应用

这篇综述系统阐述了针对肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）荚膜多糖（CPS）的功能性调理吞噬试验（OPA）开发与验证，聚焦KL2/KL15/KL25/KL62/KL102五种高流行血清型。研究通过标准化HL-60细胞系和兔补体（BRC）体系，证实抗体介导的体外杀菌效能（OI>99%），为疫苗研发提供关键免疫学评估工具（CV<25.2%），并揭示荚膜抗原（K抗原）在免疫保护中的主导作用。

　　

ABSTRACT

肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）是低收入和中等收入国家（LMICs）医院感染的主要病原体之一，其高耐药性和高死亡率对免疫缺陷患者构成严重威胁。随着抗生素耐药性（AMR）加剧，开发疫苗等预防措施迫在眉睫。本研究针对五种高流行血清型（KL2、KL15、KL25、KL62和KL102）开发了功能性调理吞噬试验（OPA），通过兔免疫血清和人类超免疫球蛋白（H-IVIG）验证了抗体介导的体外杀菌效能，且血清型间交叉反应性极低（<15%）。这些试验为评估自然免疫和疫苗免疫原性提供了关键平台。

INTRODUCTION

作为ESKAPE病原体之一，肺炎克雷伯菌因携带β-内酰胺酶（如ESBLs和碳青霉烯酶）而对多种抗生素产生耐药性。其超强毒力株（hvKp）甚至可感染健康人群。世界卫生组织（WHO）已将其列为亟需新疗法的关键病原体。该菌的两种主要毒力因子——脂多糖（LPS）和荚膜多糖（CPS）——均可作为疫苗靶点。尽管CPS存在150余种KL型，但25种血清型导致70%的菌血症感染，提示多价疫苗的可行性。

RESULTS

Strain selection and assay optimization
通过光学密度（OD1/OD2）筛选，最终选定KL2（O1）、KL15（O4）、KL25（O1）、KL62（O1）和KL102（O2afg）菌株，其非特异性杀伤（NSK）均<35%。所有菌株均需HL-60细胞参与杀菌（图1），证实OPA的必要性。

Specificity
竞争分析显示，同源CPS吸附使杀菌效能（OI）降低>99%，而异源CPS或O抗原抑制率多<15%。值得注意的是，KL102与KL15/KL62存在部分交叉反应（25.7%-37.1%），而KL2和KL15分别受O1/O4抗原影响（抑制率42%和27%）（表2）。

Precision
批间变异系数（CV）为10.4%-25.2%，批内CV为4.5%-20.5%（表3）。线性回归分析显示所有血清型R²

0.95（表4），稀释一致性达100%。

LLOQ
定量下限（LLOQ）定义为OI≥6-9，对应CFU杀伤≥70%（表4）。

DISCUSSION

本研究建立的OPA填补了肺炎克雷伯菌疫苗评估的技术空白。尽管部分菌株存在O抗原干扰，但CPS仍是主导免疫靶点。未来需扩大血清型覆盖并建立国际标准品。这些功能性试验将为疫苗保护阈值（如OI≥8）的确定奠定基础。

MATERIALS AND METHODS

关键实验步骤

1. 菌株培养：使用含2%LB的冻存菌株，OD₆₀₀
   =0.5-0.65时收获对数期细菌。
2. 多糖纯化：通过切向流过滤（TFF）和阴离子交换色谱获得CPS/OPS，经¹
   H-NMR验证结构。
3. 结合疫苗：采用CDAP/EDC化学将rCRM197载体与KL2/KL25/KL102等抗原偶联，辅以铝佐剂。
4. HL-60分化：0.8%DMF诱导5-6天，CD35表达≥55%方可用于OPA。
5. OPA核心流程：血清稀释→细菌孵育→加入BRC（4%-8.75%）和HL-60细胞→37°C震荡45分钟→TTC染色计数CFU。

统计分析
Opsotiter软件计算OI，GraphPad Prism进行线性回归（斜率-1.062至-1.131）。