靶向SARS-CoV-2主蛋白酶二聚体界面的新型变构抑制剂：通过破坏Mpro 二聚化实现抗病毒治疗新策略

本研究针对SARS-CoV-2主蛋白酶(Mpro )二聚化依赖性活性的特点，通过虚拟筛选和结构优化获得新型变构抑制剂。研究人员发现化合物1和11能特异性结合Mpro 变构位点，通过SAXS和分子动力学证实其可破坏二聚体稳定性，在感染细胞中有效抑制病毒复制。该研究为开发非催化位点靶向的抗冠状病毒药物提供了新思路。

　　

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的COVID-19疫情持续威胁全球公共卫生，病毒主蛋白酶(Main Protease, M^pro
)因其高度保守性和二聚化依赖性活性成为抗病毒药物研发的关键靶点。目前临床使用的M^pro
抑制剂如奈玛特韦(nirmatrelvir)主要靶向催化位点，但耐药突变株的出现和药物代谢局限性促使科学家探索新型作用机制的抑制剂。

在此背景下，研究人员聚焦于M^pro
二聚化这一独特生物学特征展开研究。M^pro
必须形成同源二聚体才具有蛋白水解活性，其成熟过程涉及复杂的构象变化：两个单体通过N端"指状"结构互锁，其中R298等关键残基维持二聚体界面稳定性。既往研究发现某些化合物能通过变构调节影响二聚化平衡，如抗癌药物pelitinib可稳定二聚体，而AT7519则表现出相反作用。然而，能特异性破坏二聚体的小分子抑制剂仍属罕见，其分子机制也亟待阐明。

为突破这一瓶颈，研究人员通过多学科交叉方法开展研究。首先采用虚拟筛选从ZINC15化合物库中初筛靶向M^pro
催化口袋的候选分子，发现先导化合物1具有抗病毒活性但无体外酶抑制效果。通过时间进程实验确认其作用阶段与M^pro
功能抑制相符。随后设计合成17个结构类似物，构效关系分析揭示异亮氨酸-缬氨醇侧链的立体构型对活性至关重要。

研究运用三大关键技术：1) 基于高斯加速分子动力学(GaMD)的"整体盲对接"策略，利用M^pro
单体/二聚体构象系综预测变构结合位点；2) 小角X射线散射(SAXS)定量分析化合物对二聚平衡的影响；3) NanoBit?生物传感器监测单体构象变化。临床相关样本包括SARS-CoV-2感染的人肺Calu-3细胞和Vero E6细胞模型。

研究结果可分为五个重要发现：

1. 构效关系与抗病毒活性
   通过系统结构修饰发现，保留5-氧代四氢噻唑并[2,3-a]异吲哚-3-甲酰胺骨架并具有S-缬氨醇构型的化合物11(EC₅₀
   =5.4μM)活性最佳，而R-构型类似物17完全失活。在感染细胞中，化合物11能将病毒滴度降低至1.8μM，且对多种人源细胞系无毒性(CC₅₀

250μM)。

1. 变构作用机制解析
   分子对接揭示化合物1a(化合物1的特定立体异构体)主要结合两个变构位点：单体上的次级位点(SeS，占44%)和二聚体界面位点(DS，占95%)。值得注意的是，SeS与已知变构抑制剂AT7519的结合区域重叠，两者均通过干扰R298盐桥网络影响二聚化。

2. 二聚平衡实验验证
   SAXS分析显示化合物1和11显著提高M^pro
   二聚解离常数K_D
   (从5μM增至50-60μM)，使二聚体比例从75%降至30-40%。这与pelitinib等二聚稳定剂形成鲜明对比，后者可使K_D
   降至0.2μM。

3. 单体构象调控
   NanoBit?实验证实化合物1/11能稳定M^pro
   单体的"伸展"构象，使荧光信号降低60-70%。这种构象变化可能阻碍了二聚化必需的N端结构域重排。

4. 细胞水平蛋白酶抑制
   在SARS-CoV-2感染的A549-ACE2-TMPRSS2细胞中，化合物11能完全阻断M^pro
   对报告基因底物(nsp4-nsp5切割位点)的加工，效果与奈玛特韦相当，证实其在生理环境下有效抑制M^pro
   功能。

这项研究的意义在于：首次发现能特异性靶向M^pro
单体"伸展"构象的小分子抑制剂，突破传统催化位点抑制策略的局限。通过整合计算模拟与实验验证，阐明化合物通过结合SeS变构位点破坏R298介导的二聚化网络，这种作用机制可能降低耐药风险——因为二聚界面残基在自然变异中高度保守。此外，化合物11展现出的良好溶解性(548μM)和代谢稳定性(t_1/2
=58.2分钟)为其进一步优化奠定了基础。

该研究也存在若干值得探讨的局限：化合物对猫hepsin B/L的抑制可能贡献