全基因组测序揭示肠致病性大肠杆菌(EPEC)古老分离株的新特征：毒力因子与表型关联研究

本研究通过全基因组测序(WGS)结合表型分析，对41株传统血清学分型的肠致病性大肠杆菌(EPEC)临床分离株进行系统研究。研究人员发现其中27株为真实EPEC（含21株典型tEPEC和6株非典型aEPEC），其余14株为其他病原型或非致病株。研究明确了LEE毒力岛的插入位点（selC/pheU/pheV），鉴定出3种新型T3SS效应蛋白（Ibe2/EspS2、NleG10、NleG11），并通过生物膜形成、黏附表型、IL-8抑制等实验验证基因组发现。该研究为EPEC精准分型提供了分子依据，揭示了毒力因子组合与临床表现的关联。

　　

肠致病性大肠杆菌(EPEC)是导致发展中国家婴幼儿腹泻的重要病原体，其致病性依赖于III型分泌系统(T3SS)和毒力岛(PAI)编码的效应蛋白。然而，传统基于血清型(O抗原)的分类方法存在明显局限性：WHO定义的15种EPEC血清型中，部分菌株实际缺乏关键毒力因子；而临床常见的非典型EPEC(aEPEC)因缺乏束状菌毛(Bfp)，其致病机制又与典型EPEC(tEPEC)存在差异。这些分类混乱给临床诊断和致病机制研究带来挑战。

为解决这一问题，德国明斯特大学医院的研究团队对41株历史EPEC分离株（含原型株E2348/69）开展全基因组测序(WGS)与多维度表型分析。研究通过cgMLST(核心基因组多位点序列分型)构建系统发育树，采用BLAST比对鉴定毒力因子，结合生物膜形成、酸耐受、细胞黏附、actin pedestal形成及IL-8分泌抑制等实验，揭示了EPEC基因型-表型的关联规律。相关成果发表于《International Journal of Medical Microbiology》。

主要技术方法
研究整合Illumina和Oxford Nanopore双平台测序数据，使用SeqSphere⁺
进行基因组组装和cgMLST分析（2,513个靶基因）。通过VFDB数据库注释毒力因子，采用BRIG和Easyfig软件可视化PAI结构。表型实验包括：LB/DMEM培养基生物膜定量（结晶紫染色）、HeLa细胞黏附模式观察（Giemsa染色）、actin pedestal检测（FITC-Phalloidin染色），以及ELISA定量感染后IL-8分泌水平。

3.1 临床分离株的遗传特征
cgMLST分析显示41株菌呈现血清型特异性聚类，27株确认为EPEC（21株tEPEC含bfpA，6株aEPEC）。意外发现14株"EPEC血清型"菌株实为其他病原型：5株携带AAF菌毛/ShET1毒素的肠集聚性大肠杆菌(EAEC)，1株含CS菌毛的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)，其余8株为非致病株。特别值得注意的是，tEPEC分离株Bo31存在LEE大片段缺失（含eae基因），提示单纯PCR检测可能存在漏诊风险。

3.2 selC、pheV和pheU插入PAI的确定
长读长测序精准解析了LEE毒力岛的插入位点变异：12株插入selC，6株pheV，7株pheU。发现O111:H2菌株(Bo10/11)的IE6毒力岛（含pagC-espL-nleB-nleE-lifA/efa1）异常插入cysH-higA染色体区，此为首次报道。比较基因组显示，O26:H11、O124:H4和O127:Hnt菌株的LEE核心区与IE6融合形成单一PAI，而O86:H34株则完全缺失IE6。

3.3 T3SS效应蛋白分析
效应蛋白谱呈现显著菌株差异：毒力效应蛋白数量从25个（O86:H34）到58个（O55:H7）不等。发现3个新亚型：质粒编码的Ibe2/EspS2（与IQGAP1互作蛋白新变体），以及U-box泛素连接酶家族成员NleG10（质粒携带）和NleG11（前噬菌体编码）。所有菌株均携带nleB/nleH，而IE6相关效应蛋白（espL/nleB/nleE）在92%菌株中存在。

3.4 表型特征
生长曲线显示O128:H2株(Bo38/39)代时延长至26分钟（其他株11-13分钟）。酸耐受实验发现10株菌在pH2.5下存活率>50%，包括所有O111:H2株和EAEC株Bo16。生物膜实验显示aEPEC在LB中形成强生物膜，而EAEC株在DMEM中表现显著黏附。黏附表型验证中，O114:H2株(Bo23/24)因perA基因移码突变丧