SARS-CoV-2 nsP13解旋酶ATP水解依赖性核酸解链机制：单链核酸结合与易位的关键作用

本研究针对SARS-CoV-2非结构蛋白nsP13解旋酶在病毒RNA复制中的关键作用，通过ATPγS抑制实验揭示其解链双链核酸（dsDNA/dsRNA）的机制依赖于ATP水解驱动的单链核酸（ssNA）结合与易位能力。研究发现，ATP结合增强nsP13与ssDNA亲和力，而持续水解则促进解链效率，为靶向 helicase 的抗病毒药物设计提供了新思路。

　　

论文解读
新冠病毒（SARS-CoV-2）的复制依赖其非结构蛋白nsP13的解旋酶活性，该蛋白属于超家族1（SF1）解旋酶，能沿5′→3′方向解开双链核酸（dsNA），为病毒基因组复制提供单链模板。然而，nsP13对dsDNA和dsRNA的解链效率存在显著差异，且长5′单链尾（ss-tail）对解链的调控机制尚不明确。此外，ATP水解如何影响nsP13与单链核酸（ssNA）的相互作用仍是未解之谜。这些问题的答案对开发靶向病毒解旋酶的抑制剂至关重要。

为解决上述问题，韩国Konkuk大学的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》发表研究，通过生物化学与计算模拟相结合的方法，揭示了nsP13解链dsNA的分子机制。研究发现，ATP水解驱动的构象循环是nsP13易位和解链的核心动力，而缓慢水解的ATP类似物ATPγS会“冻结”解旋酶于高亲和力状态，阻碍其功能。这一发现为设计阻断病毒复制的特异性药物提供了理论依据。

关键技术方法
研究采用FRET（荧光共振能量转移）和PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）实时监测nsP13对荧光标记dsDNA/dsRNA的解链动力学；通过Malachite Green法测定ATP水解速率；利用分子对接（AMDock/LigPlot⁺
）分析ATPγS与nsP13的结合模式；结合荧光各向异性和竞争性置换实验量化nsP13与ssDNA的亲和力变化。

研究结果

1. 双链核酸解链的荧光检测
   FRET和PAGE实验证实nsP13解链dsDNA效率（95%）显著高于dsRNA（48%），且高浓度ATP（9 mM）可完全解链dsRNA，提示RNA解链需更高能量输入（图1C-D）。

2. 方向性解链与ATP水解关联
   仅含5′-ss尾的dsDNA被高效解链，而3′-ss尾或平末端底物无活性。有趣的是，3′-ss尾仍可刺激ATPase活性，表明ssNA结合与解链功能可分离（图2A-B）。

3. ATPγS对解链的抑制作用
   分子对接显示ATPγS通过Gly285/Ser289等残基与nsP13稳定结合。实验证实ATPγS使解链效率降至7%，且通过竞争性抑制（K_i
   =0.26 mM）提高ATP的K_1/2
   值3.2倍（图3C-F）。

4. 5′尾长度的影响
   长5′-ss尾（15 nt）使dsDNA解链率提升30%，但ATPγS存在时该效应被抑制，且ATP水解量减少60%，说明尾长优势依赖持续水解（图4A-D）。

5. ssDNA结合亲和力调控
   ATPγS使nsP13-ssDNA复合物解离速率降低3倍，结合亲和力提升（K_1/2
   =47.7 nM），而ATP水解促进解离（K_1/2
   =17.7 nM），证实“结合-水解-释放”循环驱动易位（图5A-C）。

结论与意义
该研究提出nsP13解链dsNA的“双态循环”模型：ATP结合诱导闭合构象增强ssNA亲和力，而水解后构象松弛降低结合力，推动易位（图6）。ATPγS通过“冻结”闭合态阻断该循环，揭示了ATP水解动力学对解旋酶功能的决定性作用。这一发现不仅阐明了冠状病毒解旋酶的保守机制，还为开发靶向ATP结合口袋（如模拟ATPγS作用）的抗病毒药物提供了新策略。