基于Qubevirus平台的SARS-CoV刺突蛋白受体结合小基序(RBSM)关键残基鉴定及其阻断病毒入侵机制研究

本研究针对SARS-CoV入侵机制的关键科学问题，通过Qubevirus平台展示刺突蛋白受体结合小基序(RBSM)，鉴定出L472/N473/N479/D480/Y491五个关键残基。研究发现QβRBSM1能竞争性抑制假病毒入侵，同时优化了三个表位(Ep1/Ep2/Ep3)嵌合体的抗体检测体系，为开发SARS-CoV抑制剂和抗体监测生物传感器奠定基础。

　　

新型冠状病毒引发的严重急性呼吸综合征（SARS）疫情对人类健康造成持续威胁，而病毒入侵的关键——刺突蛋白（S蛋白）与宿主受体hACE2的相互作用机制仍是研究重点。尽管已有研究揭示了SARS-CoV和SARS-CoV-2 S蛋白的结构特征，但精确控制病毒入侵的最小功能单元及其关键残基尚未明确。更棘手的是，目前缺乏针对SARS-CoV的有效疫苗和特异性治疗药物，且现有抗体检测技术存在灵敏度不足等问题。

针对这些挑战，Indiana University School of Medicine的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》发表创新性研究。该团队利用Qubevirus（Qβ）噬菌体展示系统，首次鉴定出SARS-CoV S蛋白受体结合小基序（RBSM）中L472、N473、N479、D480和Y491五个关键残基，发现Qβ展示的RBSM能有效阻断假病毒入侵。同时通过表位工程优化，开发出高灵敏度的抗体检测嵌合体，为抗病毒药物和诊断工具开发提供新思路。

研究采用多项关键技术：1）噬菌体展示技术构建RBSM突变体文库；2）基于晶体结构（PDB ID: 2AJF）的接触残基预测；3）假病毒中和实验验证抑制效果；4）ELISA和斑点杂交分析抗体结合特性；5）冷冻电镜（Cryo-EM）验证噬菌体结构完整性。实验所用SARS-CoV假病毒和患者来源抗体由Virongy Biosciences和NIH提供。

关键研究发现

RBSM关键残基的功能验证
通过Qβ平台展示的RBSM单点突变体（L472E/N473E/N479V/D480N/Y491F）显示，Y491F突变使hACE2结合活性降低87%，L472E降低83%，而五重突变体（RBSM1mt）结合活性仅剩3%。结构分析揭示Y491通过氢键与hACE2的E37相互作用，L472则与hACE2的L79/M82形成疏水作用，这些相互作用对病毒入侵至关重要。

抗病毒效应验证
在假病毒竞争实验中，QβRBSM1（10⁷
pfu/ml）展现出34.9%的抑制率，而突变体QβRBSM1mt无显著抑制效果。细胞毒性实验证实重组噬菌体对HEK293T细胞无毒性，野生型Qβ仅造成15%的细胞活力下降，远低于阳性对照SDS（33%）。

表位工程优化
研究定位的三个表位（Ep1:S_441-460
、Ep2:S_601-620
、Ep3:S_781-800
）中，Ep1-Ep2天然连接形成的嵌合体（Ep12）抗体结合活性最佳。当与生物素标签（Biot-tag）组合时，表位排列顺序A₁
-Biot-tag-Ep3-Ep1-Ep2能实现最优信号传导，为抗体检测试剂盒开发提供模板。

讨论与展望
该研究首次在Qβ平台上系统解析了SARS-CoV RBSM的"五残基作用模式"，其中L472-Y491双残基突变即可实现与五重突变相当的结合抑制效果，提示这两个残基可作为药物设计的黄金靶点。表位嵌合体的优化策略突破传统线性表位的局限性，通过保留天然连接序列（Ep12）使抗体识别效率提升3倍以上。

从转化医学角度看，QβRBSM1展示的"病毒诱饵"策略为开发非抗体类抗病毒药物开辟新途径。研究者特别指出，该平台可快速适配SARS-CoV-2等其他冠状病毒的研究，其模块化设计允许灵活更换表位组合，这对应对未来突发冠状病毒疫情具有重要战略价值。冷冻电镜显示重组噬菌体保持完整二十面体结构，12个顶点均可展示RBSM，这种多价效应可能进一步增强其中和活性，这为后续剂型优化指明方向。

值得关注的是，该团队建立的"噬菌体-表位-转导肽"三位一体检测体系，通过竞争实验证实当抗S抗体浓度达4 mg/ml时可完全饱和10³
pfu/ml噬菌体的结合位点，这种定量关系为临床抗体滴度检测提供精确标尺。研究提出的技术路线已具备转化条件，其核心质粒（Deposit Number: 84639）已在Addgene平台公开，将促进全球抗冠状病毒研究的协作创新。