尼泊尔加德满都谷地水环境中病原体及抗生素抗性基因的数字化PCR精准评估

本研究针对尼泊尔加德满都谷地水环境中病原体及抗生素抗性基因（ARGs）的监测难题，采用数字化PCR（dPCR）技术对废水处理厂和饮用水源样本进行检测。研究发现，crAssphage在废水中检出率高达100%，sul1和intI1在饮用水源中检出率达91%，但污水处理厂对病原体的去除效率较低（LRV<1）。该研究验证了dPCR在复杂环境样本中的适用性，为水质安全评估提供了新方法，对公共卫生管理具有重要意义。

　　

在发展中国家，水环境污染导致的急性胃肠炎（AGE）和抗生素抗性基因（ARGs）扩散是严峻的公共卫生挑战。尼泊尔加德满都谷地作为人口密集区域，其废水处理系统效率低下，饮用水源污染严重，但传统定量PCR（qPCR）易受环境抑制剂干扰，且依赖标准曲线，限制了监测准确性。针对这一难题，日本山梨大学等机构的研究团队首次系统评估了数字化PCR（dPCR）技术在该地区水环境监测中的应用，相关成果发表于《Journal of Environmental Management》。

研究团队采用QIAcuity dPCR系统，检测了2018年采集的22份废水样本（来自氧化沟和稳定塘两种处理工艺）及2015-2016年22份饮用水井样本。关键技术包括：1）膜过滤结合DNA提取技术浓缩样本；2）分区式dPCR绝对定量分析8种病原体（如Salmonella spp.、HuAdV）和4种ARGs（如bla_NDM-1
、sul1）；3）通过Poisson分布计算拷贝数，并评估污水处理厂对数去除值（LRV）。

3.1 检测性能验证
dPCR对病原菌、病毒和ARGs的标准品检测显示优异线性（R²
≥0.988），但动态范围仅覆盖3-4个数量级，提示低丰度靶标检测存在局限。

3.2 污水处理厂病原体分布
crAssphage在废水中100%检出，成为最稳定的人类粪便指示物。尽管两种工艺（氧化沟与稳定塘）对病原体的LRV均<1，但氧化沟对Clostridium perfringens（cpe）的去除显著优于稳定塘（p<0.05），反映工艺差异影响。

3.3 饮用水源ARGs污染
sul1和intI1在91%井水中检出（7 log₁₀
copies/100 mL），与总大肠菌群污染正相关，表明地下水受人类活动显著影响。值得注意的是，碳青霉烯酶基因bla_NDM-1
未检出，提示该地区尚未出现"最后防线"抗生素耐药危机。

3.4 病原体相关性网络
JCPyV病毒与crAssphage、HuAdV等呈现强相关性（r≥0.78），支持其作为病毒污染指示物的潜力。而Campylobacter jejuni（gyrA）与cpe的高相关性（r=0.87）暗示动物源污染可能。

讨论部分指出，dPCR与qPCR的LRV结果一致性验证了两种方法的互补性，但dPCR对低浓度靶标更敏感。研究同时揭示技术局限：1）死体积损失（最高达52%）影响灵敏度；2）统一退火温度导致部分靶标检测效率下降；3）不同dPCR平台（如QIAcuity与Bio-Rad）数据可比性需标准化。

该研究首次证实dPCR适用于尼泊尔复杂水环境监测，其突破传统qPCR的抑制剂耐受优势，为资源匮乏地区的水质安全评估提供新工具。发现的高水平sul1污染警示需加强磺胺类抗生素监管，而crAssphage作为稳定生物标志物的特性，为建立低成本监测网络奠定基础。未来研究应优化样本前处理、扩大ARGs检测谱，并探索dPCR与其他技术（如宏基因组）的联合应用策略。