高速沉降速度分析超速离心技术(hs-SV-AUC)在AAV颗粒粒径分布分析中的分辨率极限评估及其多方法学比较研究

本研究针对腺相关病毒(AAV)制剂中携带不同基因负载的颗粒难以定量分析的难题，通过对比高速/低速沉降速度分析超速离心(hs-SV-AUC/ls-SV-AUC)、质谱光度法(MP)和电荷检测质谱(CD-MS)四种技术，证实hs-SV-AUC能以12次扫描实现696核苷酸(NT)差异AAV的基线分离，为基因治疗产品开发提供了分辨率最优的粒径分布(PSD)分析方案。

　　

论文解读

在基因治疗领域，腺相关病毒(AAV)因其安全性成为主流载体，但其制备过程中产生的空壳、部分填充和过度填充颗粒会显著影响治疗效果与安全性。当前行业面临的核心挑战是如何精准量化这些异质性颗粒——特别是当DNA负载差异仅696核苷酸(NT)时，传统分析方法如低速沉降速度分析超速离心(ls-SV-AUC)和质谱光度法(MP)难以区分。

为解决这一技术瓶颈，Spark Therapeutics的研究团队在《Journal of Pharmaceutical Sciences》发表研究，系统评估了高速SV-AUC(hs-SV-AUC)相对于ls-SV-AUC、MP和电荷检测质谱(CD-MS)的分辨能力。通过分析2459 NT与3155 NT的AAV混合样本，发现hs-SV-AUC在5°C条件下仅需12次紫外扫描即可实现基线分离，且能通过双波长分析同步获取蛋白/DNA组成信息。对比实验显示，各方法分辨率排序为：hs-SV-AUC > CD-MS > MP ≈ ls-SV-AUC。这一成果为基因治疗产品的质量控制提供了迄今最灵敏的粒径分布(PSD)分析工具。

关键技术方法

研究采用四种技术分析1:1混合的AAV₂₄₅₉
/AAV₃₁₅₅
样本：hs-SV-AUC(45,000 rpm, 5°C)、ls-SV-AUC(20,000 rpm)、MP(干涉反射显微镜)和CD-MS(气相分子电荷检测)。样本通过亲和层析与离子交换纯化，DNA负载经二代测序(NGS)和毛细管凝胶电泳(CGE)验证。

研究结果

AAV样本制备与表征
通过不同色谱技术纯化的AAV₂₄₅₉
和AAV₃₁₅₅
经NGS确认主要携带目标基因，CD-MS测得基因组分子量分别为0.77 MDa和1.07 MDa，与理论值(0.76/0.98 MDa)吻合。

分辨率比较
hs-SV-AUC展现出卓越的分离能力：

• 双峰间距达0.5 Svedberg单位(S)，显著优于CD-MS的0.3 MDa质量差分辨率
• MP和ls-SV-AUC仅能检测单峰，无法区分696 NT差异
• CD-MS虽可区分但需更长时间采集数据

双波长分析优势
hs-SV-AUC的260/280 nm吸光度比可准确判定各峰对应的蛋白/DNA组成，这是MP和CD-MS无法实现的。

结论与意义

该研究首次明确了hs-SV-AUC在AAV异质性分析中的技术优势：

1. 超高分辨率：可检测<700 NT的基因组差异，对双载体AAV系统开发至关重要
2. 多维度数据：同步获取沉降系数(S值)和化学成分信息
3. 标准化潜力：简化了传统SV-AUC的复杂分析流程

这些发现为基因治疗产品的工艺优化和质量控制建立了新标准，特别是对需要精确监控部分填充颗粒的临床级AAV生产具有重大指导价值。研究同时指出，MP和CD-MS更适合快速筛查，而hs-SV-AUC应作为最终放行检测的金标准。