基于毛细管电泳的多重RT-PCR试剂盒组在上呼吸道病原体检测中的开发与评估

为解决上呼吸道感染病原体检测覆盖范围有限、分型能力不足的问题，研究人员开发了基于毛细管电泳(CE)的多重RT-PCR试剂盒组。Kit A可同时检测10种病毒、2种非典型病原体和1种细菌，灵敏度达0.5 copies/μL；Kit B能对8种病原体进行22种亚型分型。该研究通过生物信息学优化引物，显著提升检测通量和阳性率，为临床病原学研究和诊断提供高效工具。

　　

呼吸道感染(RTIs)一直是全球公共卫生的重大挑战，每年造成巨大的健康和经济负担。从流感病毒到SARS-CoV-2，层出不穷的病原体不断考验着人类防控能力。尤其令人担忧的是，上呼吸道感染(URTIs)涉及的病原体种类繁多，包括流感病毒A/B型(Flu A/Flu B)、呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原体(M. pneumoniae)等十余种主要病原体，且许多病毒还存在多个亚型。传统qPCR检测受限于荧光通道数量，而FilmArray等高通量检测平台又面临成本高昂的困境。

针对这一技术瓶颈，宁波海尔施基因科技的研究团队在《Journal of Virological Methods》发表了一项创新研究。他们开发了基于毛细管电泳(CE)片段分析法的多重RT-PCR试剂盒组，通过差异化荧光标记产物长度实现多靶标同步检测。研究采用生物信息学方法筛选保守引物，优化退火温度(57-63°C)，并建立双重质控体系。

主要技术方法
从NCBI RefSeq数据库下载13种病原体基因组序列，使用ncbi-genome-download工具获取亚型数据。设计24组(KIT A)和22组(KIT B)特异性引物，通过CE片段分析实现多靶标检测。以Fenghua人民医院临床样本验证性能，对比商业试剂盒(Kit Health)评估灵敏度(最低0.5 copies/μL)和特异性。

Sequence download
研究团队系统收集了Flu A/Flu B、RSV等13种常见病原体及其亚型的基因组数据，为引物设计提供全面参考。

Annealing temperature optimization for robust amplification
通过57°C、60°C、63°C三梯度退火温度测试，证实60°C为最佳反应条件，确保24组引物(KIT A)和22组引物(KIT B)的均衡扩增效率。

Discussion
研究发现Kit A的检测范围显著优于商业试剂盒，对M. pneumoniae等难检病原体的阳性检出率提升明显。Kit B在亚型鉴别方面表现突出，即使在检测限浓度下仍能准确区分22种亚型，且各亚型间无交叉干扰。

Conclusions
该研究成功建立了覆盖上呼吸道主要病原体的CE检测体系：Kit A实现13种病原体同步检测，灵敏度达临床要求；Kit B完成8种病原体的精细分型。两者联用可提供从物种到亚型的完整病原体信息，其2-3小时检测周期和45-70美元的单样成本，在通量和经济性间取得良好平衡。

这项技术的突破性在于：首次将CE片段分析法系统应用于呼吸道多病原检测，通过创新引物设计策略克服了传统方法通量限制。特别是在后疫情时代，随着M. pneumoniae检出率升至38.8%和B. pertussis的再现，该研究为混合感染鉴别和流行病学监测提供了有力工具。正如作者Yong Wu团队强调的，这种模块化设计还可拓展至新发病原体检测，展现出广阔的临床应用前景。