基于ORF154-DIVA ELISA技术的牛结节性皮肤病感染与疫苗接种血清学鉴别方法开发

针对现有牛结节性皮肤病疫苗无法区分感染与免疫动物的难题，印度农业研究委员会团队开发了基于LSDV ORF154蛋白的DIVA-ELISA检测技术。该研究利用Ranchi疫苗株ITR区801 bp缺失的特性，通过重组表达野生型ORF154蛋白建立检测体系，灵敏度达95.77%，特异性95.42%，为全球首个LSDV DIVA兼容疫苗的推广应用提供了关键技术支持。

　　

牛结节性皮肤病(Lumpy Skin Disease, LSD)作为一种由痘病毒科Capripox病毒属病原体引起的烈性传染病，近年来在亚洲和非洲持续蔓延。其典型症状包括高热、皮肤结节、淋巴结肿大，严重时可导致60%的死亡率。印度作为全球最大牛奶生产国，自2019年疫情暴发以来遭受重大经济损失，仅因产奶量下降和贸易限制造成的损失就达数亿美元。更棘手的是，现有Neethling和KSGP株疫苗虽能控制疫情，但无法通过血清学手段区分自然感染与疫苗接种动物(DIVA)，严重阻碍了疫情监测和净化认证。

印度农业研究委员会的研究团队敏锐捕捉到本土Ranchi疫苗株的独特遗传标记——该株在ITR区存在801 bp缺失导致ORF003/ORF154基因功能丧失。基于这一发现，研究人员创新性地将野生型LSDV的ORF154蛋白开发为诊断抗原，通过原核表达系统获得28 kDa重组蛋白，建立高灵敏度(95.77%)、高特异性(95.42%)的间接ELISA方法。该成果发表于《Journal of Virological Methods》，标志着全球首个LSDV DIVA兼容疫苗配套检测技术的诞生。

关键技术包括：1) 从LSDV野毒株(MW883897.1)克隆ORF154基因至pET28a载体；2) 使用BL21(DE3)表达并镍柱纯化His标签蛋白；3) 优化ELISA条件(500 ng/well抗原量，1:50血清稀释度)；4) 采用71份疫苗免疫血清和48份感染血清验证性能。

【Viruses】研究选用印度Ranchi分离株(MW883897.1)和传代50代的疫苗株(OK422494.1)作为对照，通过基因测序确认疫苗株ITR区特征性缺失。

【Cloning, expression and purification】成功构建pET28a-LSDV.ORF154重组质粒，SDS-PAGE和Western blot验证表达产物符合预期，为后续ELISA奠定物质基础。

【Discussion】相较于传统中和试验，该ELISA操作简便且能明确区分Ranchi疫苗免疫动物与野毒感染个体。其22.63%的临界值设定有效平衡了敏感性与特异性，填补了WOAH认证体系的技术空白。

【Conclusion】这项研究不仅为印度LSD防控提供了关键工具，更开创了基于基因缺失标记开发DIVA疫苗的新范式。未来通过扩大田间验证，该技术有望成为全球LSD根除计划的核心支撑。专利(202511010744)的申请也预示着其产业化前景，为发展中国家动物疫病防控提供了可复制的技术模板。