基于限制性片段长度多态性(RFLP)的牛冠状病毒快速基因分型新方法及其在日本流行株监测中的应用

为解决传统RT-PCR/RFLP方法对部分日本牛冠状病毒(BCoV)流行株基因分型失效的问题，日本研究人员通过引入AvaII、EcoO65I、AfaI和Bsp1286I四种限制性内切酶，建立改良型RT-PCR/RFLP分析体系。该技术使296株BCoV的分型准确率提升至98.3%，为无测序条件下快速监测病毒变异提供经济高效的解决方案。

　　

牛冠状病毒(BCoV)作为引发犊牛腹泻和呼吸道疾病的重要病原，每年给全球畜牧业造成巨大经济损失。其刺突蛋白(S蛋白)的S1亚基存在高度变异的411-bp多态区，与病毒抗原性和毒力密切相关。日本自1976年首次分离Kakegawa毒株以来，BCoV已演变为4种基因型，其中2005年后流行的基因型4毒株占比达100%。传统基于AvaII和EcoO65I限制性内切酶的RT-PCR/RFLP分型方法，虽被广泛用于日本BCoV监测，但最新研究发现该方法对19株日本流行株（包括3株新分离株）存在分型失效问题。

为解决这一技术瓶颈，日本福岛县和爱媛县的研究团队开展改良研究。通过分析296株BCoV（含新分离的FKS-1、FKS-2、EHM-1、EHM-2毒株及GenBank收录株）的S1多态区序列，发现传统方法失效源于AvaII/EcoO65I酶切位点突变。研究人员创新性引入AfaI和Bsp1286I两种限制酶，建立十种电泳图谱分型标准：基因型1（1型图谱）产生177/295-bp片段，基因型3（3-1型）呈现177/390-bp条带，基因型4（4-3型）显示312/160-bp特征带等。

关键技术包括：1) 使用HRT-18G细胞培养分离临床毒株；2) 针对S1多态区设计特异性引物SL1/SR2进行RT-PCR扩增；3) 四酶联合RFLP分析；4) 基于MEGA X软件的ClustalW序列比对验证。

研究结果显示：改良方法使291株（98.3%）BCoV获得准确分型，较原方法提升显著。特别值得注意的是，所有2005年后日本流行株均被明确归类为基因型4，证实该型毒株已成为日本优势流行谱系。通过建立4-1至4-5五种新型电泳图谱，成功识别出传统方法无法区分的变异毒株。

在讨论部分，作者强调该技术突破三大局限：1) 解决酶切位点突变导致的分型失败；2) 保持无需测序的经济优势；3) 提升农场级BCoV监测效率。研究不仅为日本畜牧业提供实时疫情监控工具，其"多酶联合分型"策略更为其他RNA病毒基因分型提供技术范式。论文发表于《Journal of Virological Methods》，通讯作者Suzuki Tohru指出，该方法对预警BCoV跨种传播风险（如向野生反刍动物扩散）具有重要公共卫生价值。

结论部分明确：改良RT-PCR/RFLP技术通过扩大限制酶组合，显著提升对日本BCoV流行株的分型覆盖率和准确性。该成果为发展中国家开展经济高效的冠状病毒监测提供技术蓝本，其设计思路可延伸应用于其他高变异RNA病毒的快速基因分型需求。研究团队特别致谢Shofiqur Rahman博士的英文润色支持，并声明本研究未接受特定基金资助且无利益冲突。