D-环丝氨酸（D-cycloserine）靶向降解HBV cccDNA的体外筛选系统建立及机制探索

本研究针对乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（cccDNA）难以清除的临床难题，通过构建基于Cre-loxP系统的重组cccDNA（rcccDNA）体外筛选平台，从379种抗病毒化合物中鉴定出D-环丝氨酸可显著降低cccDNA水平及HBeAg/HBsAg分泌，为开发靶向cccDNA的治疗策略提供新思路。

　　

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球公共卫生的重大挑战，全球约有2.96亿慢性感染者。尽管核苷类似物能有效抑制病毒复制，但病毒基因组整合和核内cccDNA的长期存留仍是实现功能性治愈的主要障碍。cccDNA作为HBV的"分子记忆"，以1-10拷贝/细胞的稳定微型染色体形式存在，可导致停药后病毒反弹。现有治疗手段难以彻底清除cccDNA，亟需开发靶向降解cccDNA的创新策略。

为解决这一难题，研究人员构建了基于Cre-loxP系统的重组cccDNA（rcccDNA）体外筛选模型。通过设计包含7种HBV基因型的loxP-HBV载体，在CRE重组酶作用下形成rcccDNA，建立直接细胞裂解结合qPCR的高通量检测体系。从379种抗病毒化合物中筛选发现，D-环丝氨酸可显著降低cccDNA水平及病毒抗原分泌。

关键技术方法

1. 设计保守序列引物构建7种HBV基因型的loxP-HBV载体
2. 通过CRE重组酶诱导形成rcccDNA
3. 采用HBeAg/HBsAg ELISA和直接qPCR检测体系
4. 在HepAD38细胞系中验证化合物效果（含Dox诱导系统）
5. HBV感染模型（HepG2-NTCPsec⁺
   ）验证

研究结果

3.1 rcccDNA系统的建立
通过序列比对设计出覆盖HBV基因型A-H的保守引物，在loxP序列介导下成功构建rcccDNA。Sanger测序证实该系统能准确形成环状结构，为后续筛选提供标准化平台。

3.2 基因型差异分析
发现基因型C的HBeAg表达最高（无A1762T/G1764A突变），而基因型F的HBsAg分泌最强（含G120A启动子突变）。所有基因型均能形成rcccDNA，证实系统普适性。

3.3 化合物筛选
初筛发现10种化合物可降低cccDNA水平32-35%。在HepAD38模型中，D-环丝氨酸表现突出：使HBeAg降低40%、HBsAg降低35%、cccDNA减少32%。其异构体L-环丝氨酸仅影响cccDNA，提示特异性机制。

讨论与意义
该研究创新性地将Cre-loxP系统应用于HBV研究，克服了天然cccDNA拷贝数低的检测瓶颈。发现D-环丝氨酸的双重作用机制——既抑制抗原分泌又促进cccDNA降解，可能与其调控p38 MAPK/NF-κB通路有关。相较于CRISPR/Cas9等基因编辑技术，小分子化合物更具临床转化潜力。

值得注意的是，D-环丝氨酸作为已获批的抗结核药物和NMDA受体调节剂，其抗HBV作用的发现为老药新用提供范例。未来需进一步阐明其分子机制，并优化给药方案以平衡抗菌与抗病毒效应的剂量需求。这项发表于《Journal of Virological Methods》的研究，为开发靶向cccDNA的"治愈性"疗法开辟了新路径。