三合一RPA-LFS技术同步检测对虾三大病毒：WSSV、IHHNV与TSV的高效诊断新策略

针对对虾养殖业中WSSV、IHHNV和TSV多重感染检测难题，研究人员开发了基于重组酶聚合酶扩增(RPA)结合侧流层析试纸(LFS)的三联检测技术。该方法可在30分钟内完成101 拷贝/反应的高灵敏度检测，特异性达100%，为对虾病毒现场快速诊断提供了突破性解决方案。

　　

在水产养殖领域，病毒性疾病犹如隐形杀手，每年造成数十亿美元的经济损失。其中白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)和桃拉综合征病毒(TSV)被世界动物卫生组织(WOAH)列为必须通报的水生动物疫病，堪称对虾养殖业的"三座大山"。传统检测方法如组织病理学检查犹如"大海捞针"，而实时荧光定量PCR(qPCR)虽精准却需要昂贵设备和专业实验室，这让广大养殖场陷入"检测难"的困境。

为破解这一难题，河北某高校研究团队在《Journal of Virological Methods》发表创新成果，开发出全球首个能同步检测三种对虾病毒的三联RPA-LFS技术。这项研究犹如给养殖场配备了一台"病毒扫描仪"，只需恒温加热块和试纸条，就能在田间地头实现快速精准诊断。

研究团队采用多学科交叉策略，核心技术创新体现在：1)基于保守基因片段设计特异性引物和FAM标记探针；2)优化三重RPA反应体系实现同步扩增；3)采用生物素标记引物与胶体金试纸条结合实现可视化判读。所有验证样本均来自实验室-80℃保存的经标准方法鉴定的临床样本，包括7种病原体和健康对虾组织。

【样本准备与DNA提取】
研究选用WSSV、IHHNV、TSV等7种病原体的标准株，通过酚氯仿法提取核酸，建立严格的阴阳性对照体系，为方法特异性验证奠定基础。

【特异性引物筛选】
针对三种病毒保守区设计的引物对中，WSSV-RPA-F/R靶向VP28基因，IHHNV引物针对NS1区域，TSV引物覆盖CP区。独创性体现在RPA-R引物5'端引入生物素修饰，探针5'端添加FAM标记，3'端用C3-spacer阻断延伸，确保扩增产物能与试纸条抗体特异性结合。

【特异性验证】
在包含EHP、CMNV等7种病原体的交叉反应测试中，该方法仅对WSSV、IHHNV和TSV产生清晰条带，健康对虾组织无任何非特异性扩增，证明其"精准识别"能力。

【灵敏度测试】
采用10倍梯度稀释的质粒标准品评估检测限，结果显示最低可检出10¹
拷贝/反应的病毒核酸，与WOAH推荐的qPCR方法灵敏度相当，但将检测时间从2小时缩短至30分钟。

【临床样本验证】
在110份平行样本检测中，与实验室金标准方法的符合率达到100%，且操作人员无需专业分子生物学背景，真正实现"傻瓜式"操作。

这项研究的突破性在于首次将多重RPA技术与LFS联用，创建了对虾病毒检测的"三合一"平台。其创新价值体现在：1)温度耐受性强，37-42℃均可完成反应，适应野外环境；2)设备依赖性低，仅需普通恒温装置；3)成本较qPCR降低约70%。研究者特别指出，该技术中使用的重组酶-引物复合物能自主寻找同源序列形成D-loop区，配合nfo酶的特异性切割作用，实现了对短片段(<500bp)的高效扩增，完美规避了LAMP技术对长片段需求的局限。

该成果为水产养殖疫病监测提供了革命性工具，其推广将改变传统"送样-等待-处理"的被动防控模式，使养殖户能像使用早孕试纸一样自主检测病毒。研究团队建议下一步开发冻干试剂形式以提升田间适用性，并探索在罗氏沼虾虹彩病毒等其他水产病原检测中的应用潜力。这项来自中国科研人员的创新，正为全球对虾养殖业的可持续发展注入新的科技动能。