基于热处理匀浆与多重RT-PCR联用的马铃薯病毒简易检测技术开发及应用

为解决马铃薯病毒检测中RNA提取步骤繁琐、成本高的问题，研究人员开发了一种将叶片匀浆与引物混合后直接热处理，结合一步法多重RT-PCR(mRT-PCR)的简易检测技术。该方法灵敏度较ELISA提升10-100倍，且适用于8种马铃薯病毒的常规mRT-PCR和4种病毒实时mRT-PCR检测，为种薯认证的大规模筛查提供了高效解决方案。

　　

马铃薯作为全球第四大粮食作物，其种薯质量直接影响产量和经济效益。然而，马铃薯病毒可通过块茎代际传播，其中马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)在日本田间造成严重经济损失。传统ELISA检测法虽成本较低但灵敏度有限，而分子检测技术又受限于RNA提取的复杂步骤。如何在保证检测灵敏度的前提下简化流程，成为种薯认证体系亟待突破的技术瓶颈。

日本研究人员创新性地提出"热处理引物-匀浆混合液"策略，通过将叶片匀浆与特异性引物混合后70℃热处理5分钟，直接作为模板进行一步法多重RT-PCR。关键技术包括：优化新型引物组实现电泳分离（PVS 609 bp/PVX 894 bp）；建立100倍稀释的PBST匀浆体系；验证热处理对灵敏度提升的关键作用；拓展至8种病毒常规检测和4种病毒实时检测体系。

【Virus resources and plant materials】
研究采用机械接种或带毒块茎培育的感染叶片，-80℃保存样本。通过对比不同稀释倍数匀浆的检测限，确定100倍稀释为最佳预处理方案。

【Multiplex detection using new primer set】
新设计的PVS/PVX/EF1α引物组使扩增片段更易区分，65℃退火温度下实现PLRV/PVS/PVX/PVY/EF1α五重检测。热处理引物-匀浆混合液使PVX检测灵敏度提升10倍，PVY提升100倍。

【Discussion】
该技术突破在于发现引物存在下的热处理可显著增强病毒RNA释放效率。与滤纸法RNA提取相比，检测灵敏度提高1-10倍，且单样本处理时间缩短至15分钟。研究证实该方法对PMTV等病毒同样有效，但需注意不同病毒的最佳稀释倍数存在差异。

这项研究开创了植物病毒检测的新范式——将样本预处理与PCR扩增步骤无缝衔接。其核心价值在于：首次揭示引物参与热处理可优化病毒RNA释放；建立适用于高通量检测的标准化流程；为资源有限地区的病毒监测提供经济高效的解决方案。相关技术已具备直接应用于种薯认证体系的成熟度，未来可通过引物组合调整拓展至更多植物病原检测领域。