高维微滴数字PCR技术同步定量血清、肝脏及细胞培养中乙型肝炎病毒多种剪接变异体的创新研究

【编辑推荐】本研究针对慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染中剪接变异体(spHBV)定量技术匮乏的难题，开发了基于长片段扩增(0.3–2kbp)的高维微滴数字PCR(ddPCR)检测体系，首次实现sp1/sp2/sp3/sp8/sp9五种主要剪接变体与未剪接pgRNA的同步绝对定量。通过优化80循环扩增、探针浓度组合(>360种)等关键技术，在血清、肝组织和HepG2NTCP 细胞模型中验证了方法的敏感性，为阐明spHBV在肝癌发生和干扰素治疗抵抗中的作用提供了新工具。

　　

乙型肝炎病毒(HBV)感染全球约20亿人，其中2.54亿发展为慢性感染。尽管已知病毒剪接变异体(spHBV)与肝纤维化、肝癌发生及干扰素治疗抵抗相关，但由于缺乏标准化定量方法，其生物学机制研究长期受限。传统qPCR和二代测序(NGS)存在多重检测能力有限、成本高、无法区分双重剪接转录本等缺陷。针对这一技术瓶颈，由美国国立卫生研究院资助的研究团队在《Journal of Virological Methods》发表了突破性解决方案。

研究团队创新性地整合三大技术：长片段(300-2000bp)扩增策略减少不同靶标间的PCR效率差异；微滴数字PCR(ddPCR)通过物理分区实现单分子绝对定量；高维多重检测体系同步分析6种RNA靶标(sp1/sp2/sp3/sp8/sp9/pgRNA)。关键技术突破包括：优化80循环扩增程序、引入逆转录后纯化步骤、测试360余种探针浓度组合，并采用空间转录组技术验证剪接位点。

【Synthetic DNA, RNA, and biological samples】
使用含T7启动子的合成DNA(gBlock)构建sp1/sp2/sp3/sp8/sp9/pgRNA标准品，通过体外转录获得RNA参照。实验样本涵盖人类血清、肝组织及HBV感染的HepG2^NTCP
细胞系。

【Results】
在无标准参照物的困境下，研究首先验证合成靶标的检测限达单拷贝级别。针对临床样本的创新发现包括：sp1占循环spHBV的40-48%，与既往测序数据(77-98%)相符；通过共同引物设计校正不同长度扩增子(2447-489bp)的扩增偏差；温度梯度优化显著提升低丰度spHBV检出率。

【Discussion】
该研究建立了首个可同步定量多种spHBV与pgRNA的ddPCR体系，其技术优势体现在：1) 长扩增子设计克服短读长测序漏检双重剪接体的缺陷；2) 微滴分区消除qPCR的校准标准依赖；3) 模块化探针设计支持不同基因型的灵活适配。这些进展为阐明spHBV促进肝癌发生的分子机制、开发新型抗病毒靶点提供了关键工具。

研究团队特别指出，该方法可拓展至其他病毒/宿主嵌合转录本分析，在病毒性肝炎和病毒相关肿瘤领域具有广泛适用性。通过Tanner Grudda等作者的多学科协作，这项技术将推动HBV致病机制研究进入精确定量时代。