基于UL40位点G23136A突变的等位基因特异性qPCR技术用于牛α1疱疹病毒RLB 106疫苗株与野毒株的快速鉴别

本研究针对牛α1疱疹病毒(BoAHV1)疫苗株RLB 106与野毒株鉴别难题，开发了靶向UL40基因G23136A突变的等位基因特异性定量PCR(AS-qPCR)方法。通过建立ΔCq阈值标准，实现单步反应中精准区分疫苗株与野毒株，准确率达DNA测序水平，为疫苗免疫后野毒株入侵监测提供高效工具。

　　

牛α1疱疹病毒(BoAHV1)是引发牛传染性鼻气管炎(IBR)和生殖系统疾病的重要病原，其疫苗株RLB 106因具有温度敏感(ts)特性而被用于鼻内疫苗接种。然而现有鉴别技术存在明显局限：温度敏感表型检测需耗时7天的细胞培养，UL9基因测序无法区分疫苗株与实验室LA株，而UL40 PCR-RFLP存在与牛α5疱疹病毒(BoAHV5)的交叉反应风险。

针对这一技术瓶颈，日本国立农业食品研究机构的研究团队在《Journal of Virological Methods》发表创新成果。研究人员聚焦UL40基因特定位点，开发出基于G23136A突变的等位基因特异性定量PCR(AS-qPCR)检测体系。该研究通过建立ΔCq（定量循环差值）判定标准，结合DNA测序验证，成功实现疫苗株与野毒株的精准鉴别。

关键技术包括：1) 针对UL40基因设计RLB 106株特异性(G23136A)和野毒株(WT)靶向引物对；2) 使用MDBK细胞培养的LA株、758株等野毒株及RLB 106疫苗株进行方法验证；3) 通过梯度稀释实验确认ΔCq阈值的稳定性；4) 对28株临床分离株进行AS-qPCR与DNA测序的平行比对。

【细胞和病毒】研究采用Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞系，对比测试了实验室LA株、758株等野毒株与RLB 106疫苗株的复制特性，为方法建立提供标准参照。

【AS-qPCR开发】通过优化引物设计，发现尽管存在交叉扩增，但RLB 106株在特异性引物下的Cq值始终比野毒株低2.1-3.0个循环，据此确立ΔCq≥1.38为鉴别阈值。

【临床验证】对28株临床分离株检测显示，AS-qPCR与DNA测序结果100%吻合，且被判定为RLB 106的分离株均表现温度敏感表型，证实方法可靠性。

【讨论】该研究突破性地将AS-qPCR技术应用于疱疹病毒疫苗株监测，其单步反应特性使检测时间从传统方法的7天缩短至2小时。建立的ΔCq判定标准不受病毒载量影响，对含10¹
-10⁵
TCID₅₀
/mL的样本均保持稳定。值得注意的是，该方法特异性高于既往UL9测序法，能有效区分RLB 106与LA株；灵敏度优于UL40 PCR-RFLP，且不与BoAHV5发生交叉反应。

研究结论表明，这项AS-qPCR技术为疫苗免疫群体的野毒株入侵监测提供了高效工具，对牛呼吸道疾病综合防控具有重要实践价值。作者团队特别指出，该方法可整合入现有兽医诊断体系，其标准化操作流程适用于大规模流行病学调查，为动物疫苗质量控制和疾病净化计划提供关键技术支撑。