基于紫外诱变代谢工程改造Komagataella phaffii提升甲醇转化D-乳酸产量的机制研究

本研究针对甲醇作为石油替代碳源利用率低的问题，通过紫外诱变(UV mutagenesis)改造产D-乳酸(D-lactic acid)的Komagataella phaffii工程菌株GS115/S8/Z3，获得突变株DLac_Mut2_221使产量提升1.52倍至5.38 g/L，转录组分析揭示158个差异表达基因(DEGs)与糖酵解、乙醛酸循环(glyoxylate cycle)等代谢通路调控相关，为C1资源高值化利用提供新策略。

　　

随着全球对可持续发展和碳中和目标的追求，甲醇作为可从CO₂
和生物质合成的C1化合物，正成为替代石油的重要碳源。然而传统化学法合成化学品需高温高压条件且选择性差，而生物制造虽能在温和条件下实现高特异性转化，但甲醇代谢效率低下仍是瓶颈。以Komagataella phaffii（原名Pichia pastoris）为代表的甲基营养型酵母，因其卓越的甲醇同化能力和成熟的基因操作体系，被视为甲醇生物制造的理想宿主。D-乳酸作为重要的手性化合物，在生物塑料（如聚乳酸PLA）和制药领域具有广泛应用，但现有生产菌株从甲醇合成D-乳酸的效率（3.48 g/L）远低于葡萄糖基质（0.89 g/g），亟需突破代谢调控壁垒。

针对这一挑战，日本大阪大学的研究团队在《Metabolic Engineering Communications》发表研究，通过对代谢工程菌株GS115/S8/Z3进行两轮紫外诱变，结合多组学分析，成功构建了高效甲醇转化D-乳酸的突变株，并揭示了关键代谢重塑机制。研究采用紫外诱变（18 J/m²
照射77分钟）筛选1080个突变体，通过微孔板高通量培养和酶法检测（D-LDH）初筛，再经摇瓶发酵验证；对最优突变体进行RNA-seq转录组分析（DNBSEQ-G400测序），采用Geneious Prime进行差异基因分析（p<0.01且|log2FC|≥0.59），并通过g:Profiler进行GO和KEGG通路富集。

3.1 紫外诱变显著提升D-乳酸产量
初轮诱变获得突变株DLac_Mut1_25，产量达4.45 g/L（较亲本提高25%）；第二轮诱变进一步优化获得DLac_Mut2_221，产量提升至5.38 g/L（1.52倍），甲醇转化率达0.18 g/g。时间进程曲线显示该菌株在168小时耗尽甲醇时达到产量峰值，且生长曲线（OD₆₀₀
）显示其前期生长延缓，暗示碳流重定向至产物合成。

3.3 转录组揭示三重代谢调控机制
通过对比突变体与亲本的158个差异表达基因（99个上调，59个下调），发现：
1）甲醛解毒增强：甲醛脱氢酶（FDH）表达上调1.78倍，促进甲醛转化为CO₂
，避免毒性积累；
2）乙醛酸循环激活：苹果酸合酶（MLS）和柠檬酸合酶（CS）分别上调2.30倍和1.60倍，减少碳损失；
3）细胞壁重塑：O-糖基化蛋白PAS_0305表达下调65%，可能通过增加膜通透性促进产物分泌。GO分析显示硫胺素（THI4）合成和丝氨酸-甘氨酸代谢通路显著富集，前者通过稳定线粒体DNA增强胁迫耐受，后者经丝氨酸脱氨酶促进丙酮酸供应。

这项研究通过非理性育种与理性分析的结合，不仅创制了目前甲醇基质D-乳酸生产的最高效菌株，更首次揭示了乙醛酸循环激活与细胞壁修饰在甲醇生物转化中的关键作用。特别值得注意的是，THI4基因的上调可能通过增强氧化应激耐受性，解决了甲醇代谢中活性氧累积的共性问题；而FDH通路的强化为甲醛毒性调控提供了新靶点。这些发现突破了传统认知中仅关注AOX（醇氧化酶）和Xu5P（木酮糖-5-磷酸）路径的局限，为构建下一代甲醇细胞工厂提供了多靶点协同优化的新范式。未来结合基因组测序定位突变位点，有望实现更精准的代谢网络重构，推动C1生物制造向工业化迈进。