肠道内益生酵母菌多步途径工程化生产脱落酸(ABA)及其温度敏感性机制研究

推荐：本研究针对植物激素脱落酸(ABA)作为营养制剂面临的规模化生产难、半衰期短等问题，通过基因工程改造益生酵母Saccharomyces boulardii，整合Botrytis cinerea的bcaba1-4基因簇实现肠道定向递送。研究发现37°C体温会显著抑制ABA合成，通过增强甲羟戊酸途径和优化细胞色素P450还原酶(bccpr1)表达，使产量提升7倍，为ABA的微生物疗法提供新思路。

　　

植物激素脱落酸(ABA)近年来因其在免疫调节和抗炎方面的潜力备受关注，尤其在糖尿病、动脉粥样硬化等代谢性疾病中展现出治疗价值。然而，传统从无花果、越橘等水果提取ABA存在产量低、成本高、稳定性差等瓶颈，合成补充剂也存在生物利用度问题。这促使科学家探索新型递送系统——利用益生菌作为"活体工厂"在肠道原位生产ABA。

比利时根特大学的研究团队选择非致病性酵母Saccharomyces boulardii作为载体，该菌株已广泛用于腹泻治疗且具有优异的肠道定植能力。研究借鉴了先前在酿酒酵母中建立的ABA合成途径，从灰霉菌Botrytis cinerea引入四个关键基因(bcaba1-4)，构建了能30°C下产ABA的工程菌株。通过整合细胞色素P450还原酶基因bccpr1，使ABA滴度提升7倍，超越既往报道的S. cerevisiae生产菌。相关成果发表于《Metabolic Engineering Communications》。

研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将外源基因整合至酵母基因组，使用特异性启动子(TDH3/TEF1等)调控表达；建立灵敏的HEK 293T细胞生物传感器检测培养上清和小鼠血清ABA浓度；通过喂食含5×10⁸
CFU/g酵母的饲料或灌胃给药评估肠道定植效率；采用qPCR分析温度对基因表达的影响。

【3.1 工程菌株构建】
将bcaba1-4基因簇导入两种S. boulardii菌株(Enterol和SbP)，在30°C下获得8.6 mg/L的ABA产量。引入bccpr1使E-CABA1菌株产量跃升至9.7 mg/L，但将bccpr1与bcaba1/2融合表达未能进一步提升效率。

【3.3 肠道定植评估】
创新设计的酵母饲料使小鼠粪便中持续检出10⁶
CFU/g菌落，而灌胃组72小时后即清除。血清检测显示饲料组ABA达1.8 ng/mL，但确认部分来自饲料碗中室温下的预合成。

【3.4 温度瓶颈机制】
关键发现：37°C完全抑制ABA合成，qPCR显示TDH3启动子驱动的bcaba1/3表达下降12倍。引入RPL18B/SAC6等温度稳定型启动子未能逆转抑制，表明非单纯转录调控问题。

【3.6 代谢途径优化】
截短3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(tHMG1)的引入，使E-TCABA3菌株在37°C突破性产生0.32 mg/L ABA，证实甲羟戊酸(MVA)途径通量限制是核心瓶颈。

讨论指出，尽管工程菌能稳定通过胃肠道并保持遗传特性，但体温导致的酶活性抑制是主要障碍。研究提出了三种优化方向：①筛选耐高温ABA合成酶（如Magnaporthe oryzae来源同源酶）；②通过EPA1黏附素增强肠道上皮定植；③引入ergosterol合成突变提升菌株耐热性。该研究为"微生物细胞工厂"的温度适应性改造提供了范式，不仅对ABA递送系统开发具有启示，其揭示的37°C代谢抑制规律对其它嗜温菌工程化具有普遍参考价值。

值得注意的是，工程菌在模拟肠道酸性环境(pH 2.0)中仍保持活性，且回收菌株保持生产能力，证明S. boulardii作为递送载体的鲁棒性。未来研究需平衡代谢负荷与产物合成，如采用动态调控系统在肠道特定区域激活通路。这项跨学科研究融合合成生物学与微生物疗法，为代谢性疾病干预开辟了新途径。