利用杂合I型聚酮合酶在恶臭假单胞菌中生产3-羟基酸：可持续生物合成的工程化平台

本研究针对化学工业依赖化石资源及缺乏灵活生物合成路径的问题，通过工程化恶臭假单胞菌(P. putida)表达杂合I型聚酮合酶(T1PKSs)，成功实现3-羟基酸的高效生物合成。研究人员结合转座子测序(RB-TnSeq)和蛋白降解标签技术优化前体供应，证实P. putida作为非天然宿主的潜力，为可持续生产非天然聚酮化合物提供了新策略。

　　

随着全球对可持续化学生产的需求日益增长，传统依赖化石资源的化学工业面临严峻挑战。化学工业是CO₂
排放的主要贡献者之一，而当前缺乏能够利用可再生资源（如木质纤维素、糖类）生产石油基化学品的灵活生物合成路径。聚酮化合物是一类结构多样、具有广泛应用价值的天然产物，其生物合成主要依赖于模块化的I型聚酮合酶(Type I polyketide synthases, T1PKSs)。尽管T1PKSs在放线菌中研究较为深入，但在其他微生物宿主中的表达仍处于起步阶段，尤其是工业生产相关宿主中的表达效率低下、前体供应不足等问题制约了其应用。

针对这一挑战，来自美国劳伦斯伯克利国家实验室等机构的研究团队选择恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)作为宿主，系统评估了其表达工程化T1PKSs和生产3-羟基酸的潜力。P. putida以其快速生长、代谢多样性和利用非传统原料的能力著称，是理想的生物制造平台。研究人员通过优化磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)活性、扩展酰基辅酶A库、设计新型培养基等策略，成功实现了多种3-羟基酸的高效生产。相关成果发表在《Metabolic Engineering Communications》上，为可持续生物制造提供了重要技术支撑。

研究团队采用了多项关键技术：1) 利用蓝色色素合成酶A(BpsA)报告系统评估内源PPTase活性；2) 通过转座子测序(RB-TnSeq)分析分支链氨基酸(BCAA)代谢网络，鉴定关键酰基辅酶A脱氢酶(ACDHs)；3) 开发工程化蛋白降解标签(ssrA)调控malonyl-CoA:ACP转酰酶(FabD)水平；4) 采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)定量3-羟基酸产量。

研究结果可分为五个主要部分：

2.1 磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性和聚酮延伸单元供应
研究发现P. putida内源的PPTase足以激活T1PKSs的酰基载体蛋白(ACP)结构域，外源添加Bacillus subtilis的Sfp酶反而使聚酮产量降低40%。团队成功表达了两种甲基丙二酰辅酶A(mmCoA)合成路径：来自Sorangium cellulosum的mutase/epimerase(MCM/EPI)途径和来自Streptomyces coelicolor的propionyl-CoA carboxylase(PCCase)复合体途径，前者使3-羟基-2,4-二甲基戊酸(3H24DMPA)产量提高60%。

2.2 LipPKS起始单元代谢的BarSeq分析
通过RB-TnSeq筛选鉴定了BCAA代谢中的关键基因，包括编码酰基辅酶A脱氢酶的PP_2216、PP_3492和PP_4064。三重缺失株ΔPP_2216ΔPP_3492ΔPP_4064完全丧失了以BCAA为碳源生长的能力，证实这些酶在起始单元代谢中的核心作用。

2.3 非甲基化3-羟基酸的生产
将LipPKS的酰基转移酶(AT)结构域替换为ansamycin PKS模块8(AnsM8)的AT后，3-羟基-4-甲基戊酸(3H4MPA)产量提高60%，而borrelidin PKS模块1(BorM1)的AT则未能产生可检测产物，表明AT交换边界对功能表达至关重要。

2.4 利用蛋白降解标签调控malonyl-CoA水平
设计三种工程化ssrA降解标签(LAA、DAS、LDD)调控GFP表达水平，其中DAS标签使malonyl-CoA:ACP转酰酶(FabD)降解速率适中，显著提高了黄酮类化合物flaviolin的产量，证实该策略可精细调控代谢通量。

2.5 培养基优化和菌株评估
优化后的mM9培养基(含100mM葡萄糖和10mM L-谷氨酰胺)使3H4MPA产量提高3倍。在ΔPP_0642ΔPP_2216ΔPP_3492ΔPP_4064菌株中，3H4MHA产量达到2.5±0.1mg/L，同时发现假定的3-甲基-2-氧代丁酸转运蛋白PP_0642影响前体供应。

研究结论指出，P. putida作为T1PKSs的非天然宿主具有显著优势：内源PPTase活性充足，mmCoA供应路径灵活可调。通过RB-TnSeq指导的代谢工程和蛋白降解标签技术，成功解决了前体供应限制这一关键瓶颈。尽管目前产量仍较低，但工程化PKSs的模块化特性使其成为生产特种化学品的理想平台。该研究不仅为3-羟基酸的可持续生产提供了新思路，其建立的宿主优化策略也可推广至其他高值化合物的生物制造，对推动绿色化学工业发展具有重要意义。

讨论部分强调，相比传统放线菌宿主，P. putida具有生长快速、代谢网络清晰、可利用多样化原料等优势。研究首次在P. putida中实现了PCCase路径的功能表达，并发现MCM/EPI路径效率更高。对BCAA代谢的深入解析为后续理性设计提供了重要依据，而工程化ssrA标签技术则为代谢调控提供了新工具。未来通过组合优化mmCoA供应路径、完善AT结构域交换策略，有望进一步提高聚酮化合物产量和多样性。