酿酒酵母在复杂培养基中的13 C代谢流分析揭示氨基酸并行碳源利用机制

本研究针对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在复杂培养基中代谢通量分布认知不足的问题，通过平行标记实验和氨基酸摄取速率测量，首次实现YPD等复杂培养基的13 C代谢流分析(13 C-MFA)，发现谷氨酸类氨基酸(Glu/Gln/Asp/Asn)与葡萄糖并行进入TCA循环，揭示复杂培养基中氧化磷酸戊糖途径(oxPP)和回补途径通量降低、乙醇产量提升的代谢特征，为工业发酵优化提供新见解。

　　

在微生物代谢研究领域，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为"细胞工厂"广泛应用于食品工业和生物制造。尽管合成培养基中的代谢研究已较为深入，但工业发酵更常用的酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖(YPD)等复杂培养基却缺乏系统研究。这主要因为复杂培养基含多种未标记碳源，传统¹³
C代谢流分析(¹³
C-MFA)技术难以准确追踪代谢路径。

来自国内的研究团队在《Metabolic Engineering Communications》发表的研究中，创新性地采用平行标记策略，结合氨基酸摄取速率测定，首次实现了酿酒酵母在SD+AA(合成培养基+20种氨基酸)、YPD和麦芽提取物(ME)培养基中的精确代谢流分析。研究发现谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)会作为并行碳源进入TCA循环，并揭示复杂培养基中氧化磷酸戊糖(oxPP)和回补途径通量显著降低、乙醇产量提升的独特代谢特征。

研究主要采用四项关键技术：1) 平行¹³
C标记实验设计([1-¹³
C]和[U-¹³
C₆
]葡萄糖)；2) 气相/液相色谱-质谱联用技术(GC/LC-MS)测定代谢物同位素分布；3) 氨基酸摄取速率精确测定；4) 基于mfapy工具的代谢网络建模与通量计算。实验使用二倍体实验室菌株BY4947，通过分批培养获取代谢稳态数据。

【研究结果】

3.1 合成与复杂培养基培养特征
比较SD、SD+AA和YPD培养基发现，复杂培养基中酵母比生长速率提高20-45%，最终生物量显著增加。尽管葡萄糖摄取率相近，但YPD培养基中乙醇生产率提升21%，显示碳流向发酵产物增强的特征。

3.2 氨基酸向中心碳代谢的整合
[U-¹³
C₆
]葡萄糖标记实验显示，糖酵解中间体完全标记，而TCA循环中间体标记率显著降低。特别是α-酮戊二酸(aKG)和苹果酸(Mal)的标记模式分别与蛋白源Glx(谷氨酸/谷氨酰胺)和Asx(天冬氨酸/天冬酰胺)高度相似，证实这些氨基酸直接参与中心代谢。

3.3 Gln/Glu/Asp/Asn摄取与生物量合成需求平衡
定量分析显示，SD+AA培养基中Glx摄取速率(0.192 mmol/gDCW/h)与生物量合成需求(0.270 mmol/gDCW/h)基本匹配，而YPD中Glu摄取超出需求，表明其额外作为碳源被利用。

3.4 复杂培养基中的代谢通量分布
¹³
C-MFA揭示：在SD+AA和YPD中，oxPP通量分别降至SD培养基的7%和0-33%，回补途径通量减少66%。相应地，乙醇合成通量提升至24.1-25.6 mmol/gDCW/h，较SD培养基(21.45)显著增加。

3.5 ME培养基验证
在麦芽提取物培养基中重现了YPD的代谢特征，oxPP和回补途径通量分别为0.1和0.5 mmol/gDCW/h，证实方法在更复杂体系中的适用性。

【结论与意义】
该研究突破性地建立了复杂培养基中酿酒酵母代谢流分析的新范式。发现谷氨酸类氨基酸的并行碳源利用模式，解释了工业培养基中酵母生长加速的代谢基础——通过减少oxPP和回补途径的碳损耗，将更多葡萄糖导向乙醇发酵。这一发现不仅完善了对酵母"Crabtree效应"的认知，更为代谢工程提供了新靶点：在氨基酸充足条件下，可针对性优化NADPH供应路径以提高产物得率。

方法学上，平行标记与摄取速率测量的创新结合，为研究其他微生物在复杂环境中的代谢提供了模板。特别值得注意的是，研究揭示的酵母"类谷氨酵解"现象(glutaminolysis-like metabolism)，与肿瘤代谢有惊人相似性，为比较进化研究提供了新视角。未来可扩展该方法研究工业菌株在实际发酵条件下的代谢重构，推动生物制造过程的精准优化。