mRNA内化与胞内运输的评估策略：基于荧光标记和显微技术的定量可视化研究

为解决mRNA疗法中递送效率低下的关键瓶颈，荷兰马斯特里赫特大学医学中心团队通过荧光标记（MFP488）和多重显微技术（CLEM），系统评估了脂质载体（Lipofectamine 3000/3DFect）在三种原代细胞（hMSCs/hDFs/hOBs）中的内吞途径。研究发现，clathrin/caveolae介导的内吞主导mRNA摄取，而溶酶体滞留率仅2-4%，为优化递送系统提供了精准靶点。

　　

mRNA疗法近年来在疫苗开发和疾病治疗领域大放异彩，但如何让这些携带遗传指令的"分子快递员"高效穿越细胞膜屏障，仍是制约其临床应用的关键难题。由于mRNA分子量大、带负电且易被核糖核酸酶(RNase)降解，裸mRNA几乎无法自主进入细胞。即便借助脂质载体(LNP)等递送系统，大量mRNA仍会困在溶酶体"牢笼"中被降解，无法抵达细胞质发挥功能。这种"最后一公里"的递送瓶颈，使得科学家们迫切需要精准评估mRNA在细胞内的旅行路线。

荷兰马斯特里赫特大学医学中心的研究团队在《Methods》发表了一项方法论研究，通过多学科技术联用，绘制了mRNA从进入细胞到命运终点的完整路线图。研究人员选取三种具有临床意义的原代细胞——间充质基质细胞(hMSCs)、真皮成纤维细胞(hDFs)和成骨细胞(hOBs)，采用荧光标记的Metridia荧光素酶(MetLuc) mRNA作为示踪分子，结合流式细胞术、相关光电子显微镜(CLEM)等前沿技术，首次系统比较了不同内吞途径对递送效率的影响。

关键技术包括：1) 使用MFP488染料标记mRNA并计算碱基-染料比；2) 动态光散射(DLS)表征脂质复合物粒径和zeta电位；3) 流式细胞术定量三种内吞抑制剂(氯丙嗪/渥曼青霉素/金雀异黄素)处理的细胞摄取率；4) CLEM实现纳米级精度的胞内定位；5) LysoTracker?示踪溶酶体共定位。

脂质复合物表征
粒径约400 nm、多分散指数0.26的脂质体呈现典型囊泡结构，封装效率近100%。电镜显示其具有多层内部结构，这种"俄罗斯套娃"式设计可能影响释放动力学。

转染效率的细胞差异
hMSCs中clathrin和caveolae途径抑制剂使蛋白表达降低50%以上，而hDFs仅caveolae抑制显著阻断表达。令人意外的是，hOBs对所有抑制剂均无反应，暗示存在未知的"后门"摄取机制。

内吞途径定量分析
流式数据显示，hMSCs和hDFs中caveolae途径抑制剂使mRNA摄取率从30%骤降至1%，效果强于clathrin抑制。这种"双重保险"机制解释为何同时阻断两条通路才能完全抑制转染。

CLEM可视化突破
高分辨电镜捕捉到mRNA脂质体通过膜穴样凹陷(caveolae)内吞的瞬间，部分复合物附着在细胞膜"凹坑"边缘，如同搭上分子滑梯。更有趣的是，某些hOBs细胞膜表面出现独特的"火山口"样结构，可能是其特殊摄取方式的形态学证据。

溶酶体陷阱评估
尽管三种细胞溶酶体共定位率仅2-4%，但hOBs的滞留量是hMSCs的两倍。这种差异与转染效率数据吻合，暗示溶酶体逃逸效率决定最终蛋白产量。

这项研究的意义在于建立了mRNA递送评估的金标准：首先，证明caveolae途径是脂质体递送的主要"高速路"，为载体优化指明方向；其次，CLEM技术首次揭示mRNA在原生细胞中的精确定位，突破传统显微镜的分辨率极限；最后，发现原代细胞存在显著异质性，强调个性化递送策略的必要性。

特别值得注意的是，近中性电荷(-4 mV)脂质体仍能高效递送，颠覆了"正电荷载体更优"的传统认知。这为开发低毒性的临床级载体提供新思路。未来，结合超分辨活细胞成像等技术，或将实现mRNA胞内旅程的"实时直播"，推动基因药物迈向精准医疗新时代。