基因工程改造Pseudomonas putida KT2440合成高价值吡嗪衍生物的代谢途径研究

研究人员针对化学合成吡嗪衍生物效率低、污染大的问题，通过基因工程改造Pseudomonas putida KT2440，构建了从葡萄糖出发合成2,5-二甲基吡嗪(2,5-DMP)及其衍生物(包括N-氧化物和羧酸)的全新代谢途径，实现了2,5-DMP产量168±20 mg L-1 、5-甲基-2-吡嗪羧酸(MPCA)204±24 mg L-1 的突破，为药物和香料生产提供了绿色生物合成方案。

　　

吡嗪类化合物作为重要的香料和药物中间体，目前主要依赖化学合成，存在环境污染和工艺复杂等问题。2,5-二甲基吡嗪(2,5-DMP)及其衍生物广泛应用于食品香料(如可可风味)和医药领域(如抗结核药吡嗪酰胺)，但传统化学合成面临严峻挑战：Maillard反应和Strecker降解效率低下，而生物催化途径又受限于多菌株协作的复杂性。例如，现有报道需要三种不同重组大肠杆菌分阶段发酵才能生产5-甲基-2-吡嗪羧酸(MPCA)。更棘手的是，2,5-DMP的N-氧化物衍生物(如2,5-DMP-1-氧化物)作为药物合成关键中间体，此前尚未实现从头生物合成。

针对这些技术瓶颈，国外研究团队选择Pseudomonas putida KT2440作为新型宿主，通过系统代谢工程策略开辟了吡嗪衍生物生物合成新路径。这项发表在《Metabolic Engineering Communications》的研究，创新性地将非血红素二铁单加氧酶PmlABCDEF(Pml)和XylMABC(XMO)整合到代谢网络中，首次在单一微生物宿主中实现了从葡萄糖到多种高值吡嗪衍生物的全合成。

研究采用的关键技术包括：1) 基于双交换重组技术的多基因无痕敲除，构建KT2440Δ6工程菌株；2) 反馈抑制解除策略，引入大肠杆菌来源的ThrA^S345F
变体酶；3) 多质粒共表达系统调控L-苏氨酸代谢流；4) HPLC-MS联用技术定量分析代谢产物。

【2.1 2,5-DMP衍生物生产策略设计】
研究团队设计了两条并行修饰途径：Pml催化2,5-DMP的N-氧化生成1-氧化物和1,4-二氧化物；XMO则负责甲基氧化生成MPCA。通过KEGG数据库分析，确定了L-苏氨酸代谢作为核心骨架合成路径，同时标记出6个需要敲除的竞争性支路基因(asnB、dapA-II等)。

【2.2 L-苏氨酸和2,5-DMP生产菌株构建】
KT2440Δ6工程菌展现出卓越的L-苏氨酸保留能力，在2.38 g L^-1
初始浓度下，24小时后仍保留1,475±347 mg L^-1
，而野生型菌株完全耗尽底物。引入大肠杆菌Tdh后，2,5-DMP产量达308±9 mg L^-1
，转化率34%，较野生型提升2.4倍。

【2.3 KT2440Δ6中L-苏氨酸和2,5-DMP生物合成的强化】
通过组合表达反馈抑制解除的ThrA^S345F
与内源thrB/thrC，L-苏氨酸产量提升至625±65 mg L^-1
。最优质粒组合(pBAD2_tdh + pJNN_thrA^S345F
_thrB_thrC)使2,5-DMP产量达168±20 mg L^-1
，为后续衍生化奠定基础。

【2.4 2,5-DMP功能化途径】
引入Pml系统后，2,5-DMP-1-氧化物和1,4-二氧化物产量分别达82±8 mg L^-1
和11±2 mg L^-1
；XMO途径则实现MPCA产量204±24 mg L^-1
。值得注意的是，这是首次报道在摇瓶培养中用单一宿主完成MPCA全合成。

在讨论部分，作者强调该研究突破了非血红素二铁单加氧酶在代谢工程中的应用瓶颈。相比大肠杆菌系统需要11个基因和三菌株协作，本体系仅需4个关键酶即实现更高效生产。研究还揭示了辅因子平衡的重要性——NAD(P)H供给不足可能是转化不完全的关键限制因素。

这项工作的里程碑意义在于：1) 建立了Pseudomonas putida KT2440作为吡嗪合成的优选宿主；2) 开发了首个2,5-DMP N-氧化物的从头合成途径；3) 为降脂药阿昔莫司(acipimox)的生物合成奠定基础。未来通过CRISPR-Cas9基因组整合和辅因子工程，有望进一步提升产量至工业化水平。该研究为绿色生物制造高值含氮杂环化合物提供了全新范式。