Azu-Eos荧光免染技术的开发与验证：彗星试验中增强明场显微镜检测DNA损伤的新方法

推荐：针对彗星试验(comet assay)依赖荧光染色、设备昂贵且样本无法长期保存的瓶颈，研究人员开发了Azure B-Eosin Y(Azu-Eos)荧光免染技术。该技术通过优化染料配比和缓冲体系，在普通明场显微镜下即可获得媲美荧光染色的DNA损伤检测效果，支持样本永久保存和重复检测，为环境毒理监测和临床诊断提供了更经济便捷的解决方案。

在基因组稳定性研究领域，彗星试验（单细胞凝胶电泳，SCGE）因其高灵敏度检测DNA损伤的能力而广受青睐。然而这项技术长期面临三重困境：必须使用荧光染料、依赖昂贵的荧光显微镜、样本无法长期保存。这些问题严重限制了其在现场检测和长期追踪研究中的应用。面对这些挑战，来自保加利亚科学院的研究团队独辟蹊径，开发出名为Azu-Eos（Azure B-Eosin Y）的创新染色技术，为这一经典实验方法带来了革命性突破。

研究团队通过系统优化Azure B和Eosin Y两种染料的配比、缓冲体系及染色条件，成功建立了稳定的染色方案。关键技术包括：采用六种不同来源的细胞系（如CCL-1小鼠成纤维细胞、PC-3人前列腺癌细胞等）和动植物组织样本（大鼠肝脏细胞、蕨类植物叶细胞）；建立中性、碱性和染色质三种彗星试验变体；通过微球菌核酸酶(MNase)处理构建标准损伤模型；使用Comet Score?和ImageJ软件进行图像分析对比。

研究结果显示，Azu-Eos技术在多方面展现出卓越性能。在方法开发部分，通过调整染料摩尔比至6.8:1、控制pH7.2的磷酸缓冲体系，实现了10分钟快速染色。与传统SYBR Green I荧光染色相比，Azu-Eos染色的彗星在长度、尾矩(TM)等关键参数上表现更优，平均强度提高37.5%，尤其在彗尾细节呈现上优势明显。技术适用性验证表明，该技术可广泛应用于不同来源样本，包括培养细胞（如CCL-1、PC-3）、动物组织（大鼠肝脏）和植物细胞（蕨类叶片），且在碱性和中性SCGE条件下均表现稳定。

特别值得注意的是，Azu-Eos技术解决了样本保存的行业难题。实验证实染色后的玻片可常温保存四年以上而不褪色，且已荧光染色的样本仍可重新进行Azu-Eos染色获得更清晰的图像。机制研究表明，染色过程遵循Romanowsky-Giemsa效应(RGE)的动态循环：Azure B先与DNA/蛋白质结合形成复合物，继而与Eosin Y结合，最终通过多轮循环实现信号放大。

这项发表于《Methods》的研究具有多重重要意义。在方法学层面，Azu-Eos技术首次实现了彗星试验的荧光免检，使普通实验室无需昂贵设备即可开展高质量DNA损伤检测。在实际应用方面，其样本可长期保存的特性为环境毒理监测提供了追溯分析可能，而兼容智能手机成像的特点更使其适用于现场快速检测。研究者特别指出，该技术在医疗诊断领域潜力巨大，可用于追踪患者治疗反应和预后评估。未来，这项突破性技术或将重新定义彗星试验的标准操作流程，推动基因组稳定性研究进入更经济、更便捷的新时代。