无标记光谱共聚焦反射显微镜(SCoRe)在离体神经成像及神经结构可视化中的应用研究

本研究针对传统神经成像技术依赖标记物的局限性，开发了光谱共聚焦反射显微镜(SCoRe)技术，成功实现了大鼠脑组织无标记、高分辨率成像。研究人员通过多波长反射光检测，清晰区分大脑皮层、胼胝体、海马等区域神经纤维结构，并与传统组织化学染色和免疫荧光技术兼容。该技术为神经科学研究提供了经济高效的新型工具，显著降低长期研究成本。

　　

神经科学研究长期以来依赖荧光标记技术观察脑组织结构，但荧光标记存在光漂白、自发荧光干扰以及高昂的试剂成本等问题。传统组织化学染色虽能显示髓鞘结构，却无法实现三维成像。在此背景下，墨西哥国立自治大学神经生物学研究所的研究团队在《Methods》发表论文，开发了光谱共聚焦反射显微镜(Spectral Confocal Reflectance microscopy, SCoRe)技术，通过检测组织固有反射光信号，实现了无标记、高分辨率的神经结构可视化。

研究采用Zeiss LSM880共聚焦系统，配置488 nm、543 nm和633 nm三波长激光，通过优化光学路径（T80/R20分光镜）和检测参数（1 Airy unit针孔），对SD大鼠脑组织切片进行多模态成像。样本队列包括未染色、Black Gold II染色和MBP免疫荧光标记的相邻切片。关键技术包含：1）多波长反射信号采集；2）与透射光/荧光成像同步获取；3）基于Z-stack的3D重建；4）大尺度图像拼接（最大675 tiles）。

研究结果部分显示：
3.1 未染色样本的SCoRe成像
三波长组合成功区分大脑皮层、胼胝体等区域的髓鞘结构，白质因强反射呈现亮白色，空间分辨率达213 nm（NA=1.4）。与BGII染色和MBP-DAPI免疫荧光相比，SCoRe无需标记即可获得可比的结构信息。

3.2 染色样本的兼容性
在BGII染色样本中，SCoRe图像对比度增强，髓鞘区域呈现特征性红色调（633 nm透射增强）。免疫荧光样本的SCoRe信号与未染色样本一致，证实技术兼容性。同步获取的透射图像显示，SCoRe能更清晰分辨海马亚区等精细结构。

3.3 补充性应用
SCoRe与DAPI核染色的联用，成功定位小脑浦肯野细胞（反射暗区与荧光信号共定位）。通过Z-stack重建获得胼胝体等结构的3D投影，视频数据展示10 μm厚度的立体结构。

讨论指出，SCoRe技术的核心优势在于：1）利用髓鞘脂质成分的强反射特性实现无标记成像；2）通过三波长RGB策略平衡信息量与采集效率；3）表面平整度是图像质量的关键因素。与二次谐波(SHG)等非线性显微技术相比，SCoRe在常规共聚焦系统上即可实现，更具普及价值。在浦肯野细胞等非髓鞘结构的识别，提示该技术可能拓展至细胞核可视化领域。

该研究证实SCoRe可作为传统神经成像技术的替代或补充方案，特别适用于：1）快速初筛实验样本；2）长期追踪研究（避免荧光衰减）；3）资源有限实验室的高性价比选择。未来在病理模型（如脱髓鞘疾病）中的应用，将进一步验证其临床转化潜力。