Celastrol靶向CKB介导的无效肌酸循环调控人棕色脂肪细胞产热机制研究

为解决肥胖治疗中Celastrol分子靶点不明的问题，南京团队通过合成光亲和探针Cel-p，结合PAL和SPR技术首次揭示其直接结合靶点CKB，证实Celastrol通过稳定CKB蛋白增强无效肌酸循环(FCC)促进线粒体ATP生成，为肥胖治疗提供新靶点策略。论文发表于《Metabolism Open》。

　　

肥胖及其引发的2型糖尿病、心血管疾病等代谢综合征已成为全球健康挑战。传统中药雷公藤提取物Celastrol虽被证实具有显著减重效果，但其促进脂肪细胞产热的具体分子机制始终未明，尤其在人棕色脂肪细胞中的靶点识别存在重大空白。这一科学问题的破解，不仅关乎Celastrol的临床应用转化，更对开发新型抗肥胖药物具有指导意义。

南京的研究团队在《Metabolism Open》发表的研究中，创新性地合成光亲和探针Cel-p，通过多组学技术首次锁定Celastrol的直接作用靶点——肌酸激酶B型(CKB)。研究发现Celastrol通过稳定CKB蛋白结构，激活无效肌酸循环(FCC)这一UCP1非依赖性产热通路，显著提升线粒体ATP合成效率。该成果为肥胖治疗提供了全新靶点策略，同时揭示了天然小分子调控能量代谢的精细机制。

关键技术方法包括：1) 设计含二嗪环的光亲和探针Cel-p；2) 采用光亲和标记(PAL)结合LC-MS/MS鉴定靶蛋白；3) 表面等离子共振(SPR)验证Celastrol与CKB的直接互作；4) 构建CKB敲降的人原代棕色脂肪细胞模型；5) 通过Seahorse线粒体压力测试分析氧消耗率(OCR)。

3.1 荧光标记验证Celastrol靶标
研究团队在Celastrol的C29位引入光反应基团合成Cel-p探针，细胞实验证实其保留了母体化合物的生物活性。凝胶荧光显示20 μM Cel-p可浓度依赖性标记多个蛋白条带，且该标记能被过量Celastrol竞争性抑制，证实探针特异性。

3.2 LC-MS/MS靶标筛选
通过稳定同位素标记定量蛋白质组学，鉴定出139个Cel-p结合蛋白和235个Celastrol竞争性结合蛋白。GO分析显示这些蛋白富集于AMPK信号通路等能量代谢相关过程，其中CKB因与产热机制的高度关联性成为重点研究对象。

3.3 CKB直接互作验证
SPR检测显示Celastrol与重组人CKB蛋白结合解离常数KD=21.41 μmol/L。分子对接模拟揭示Celastrol通过精氨酸236/341位点与CKB结合。Western blot证实Cel-p和另一探针Cel-a均可特异性富集CKB蛋白。

3.4 CKB蛋白稳定性调控
在分化的人棕色脂肪细胞中，Celastrol使CKB蛋白表达提升1.5倍但不影响mRNA水平。环己酰亚胺追踪实验显示Celastrol显著延长CKB半衰期，蛋白酶体抑制剂MG132处理进一步证实其通过抑制泛素化降解途径稳定CKB蛋白。

3.5 CKB介导的产热机制
CKB敲除实验证实，Celastrol诱导的线粒体ATP产量增加和质子漏减少均依赖CKB表达。值得注意的是，该过程不改变UCP1蛋白水平，明确揭示了Celastrol通过CKB-FCC通路而非经典UCP1途径促进产热。

这项研究首次阐明Celastrol通过靶向稳定CKB蛋白激活无效肌酸循环的分子机制，突破了传统UCP1中心论的认知框架。相较于既往报道的HSF1-PGC1α转录调控通路，CKB介导的快速能量消耗途径为开发速效抗肥胖药物提供了新思路。尽管Celastrol存在生物利用度低等局限性，但该发现为设计选择性CKB激动剂奠定了理论基础。未来针对CKB蛋白降解通路的深入研究，或可开辟代谢性疾病治疗的全新干预策略。