基于NGS的无痕CRISPR基因编辑技术在人干细胞中的高效精准应用

本研究针对传统CRISPR/Cas9在hiPSCs和hESCs中敲入(KI)效率低(2-20%)的难题，开发了一种结合低密度接种与NGS筛选的无痕编辑策略。通过优化转染流程和sgRNA/ssODN设计，在hiPSCs中实现64%的Brugada综合征相关CACNA1Cc.989C>T 变异敲入效率，在hESCs中实现51%的神经发育障碍(NDD)相关ANK3c.4705T>G 变异敲入。即使在KI效率<1%的ADNPc.1676dupA 案例中，仍成功筛选出目标克隆。该技术避免了荧光/抗生素筛选对基因组完整性的影响，为疾病模型构建提供了高效解决方案。

　　

基因编辑技术近年来在疾病模型构建和基因治疗领域展现出巨大潜力，但如何在人干细胞中实现高效精准的基因修饰仍是重大挑战。传统CRISPR/Cas9系统在人类诱导多能干细胞(hiPSC)和人胚胎干细胞(hESC)中的敲入(KI)效率普遍偏低(2-20%)，迫使研究人员需要手动筛选数百个克隆，费时费力。更棘手的是，常用的荧光标记或抗生素筛选方法可能损害细胞活力和基因组完整性。这些问题严重制约了疾病相关基因功能研究和精准医疗的发展。

针对这些技术瓶颈，比利时安特卫普大学的研究团队在《Methods》发表了一项创新性研究。他们开发了一种基于下一代测序(NGS)的无痕CRISPR编辑策略，通过优化转染条件和严格遵循设计原则，在hiPSCs中实现了64%的Brugada综合征相关CACNA1C^c.989C>T
变异敲入效率，在hESCs中实现了51%的神经发育障碍(NDD)相关ANK3^c.4705T>G
变异敲入。即使在设计受限、平均KI效率低于1%的情况下，该方法仍成功鉴定了携带ADNP^c.1676dupA
变异的hESC克隆。

研究采用了多项关键技术：1)使用HiFi SpCas9 V3和合成sgRNA降低脱靶效应；2)通过核转染程序优化实现90%以上的转染效率；3)设计120nt不对称单链寡核苷酸(ssODN)作为修复模板；4)采用10细胞/孔的低密度接种减少遗传异质性；5)建立靶向NGS分析流程快速鉴定编辑克隆。所有实验均使用临床级WA09 hESC系和实验室自建的hiPSC系。

3.1 CACNA1C基因编辑验证工作流程
通过精心设计两个靠近突变位点的sgRNA（切割位点距目标仅4-7bp），结合四种ssODN构型，在hiPSCs中获得最高64.15%的KI效率。低密度接种后，82个测序孔中有6个显示≥90% KI reads，经Sanger验证获得纯合(HMZ)克隆。单核苷酸多态性(SNP)芯片分析证实基因组稳定性，三系分化实验维持多能性。

3.2 hESCs中的高效编辑验证
在ANK3基因编辑中，比较三种sgRNA发现效率差异显著(96% vs 0%)，强调多sgRNA测试的必要性。使用EN-150程序与TAP ssODN组合达到50.67%平均效率。10细胞接种的孔中24.1%可直接鉴定目标克隆，较50细胞接种效率提升4倍。

3.3 低密度接种的优化价值
综合两个基因的数据显示：10细胞/孔接种可使48.2%的孔产生明确信息（含目标克隆或可弃置），而50细胞/孔仅11.3%。这种"自然稀释"策略避免了流式分选的压力，显著提高筛选效率。

3.4 挑战性条件下的成功验证
在ADNP基因编辑中，尽管最近sgRNA切割位点距目标12bp且平均KI效率仅0.91%，仍从62个测序孔中鉴定出2个含22.44%和8.44% KI reads的孔，经三轮亚克隆获得理想杂合(HTZ)克隆。

这项研究的重要意义在于建立了一套标准化、可重复的基因编辑流程。通过严格的质量控制（包括脱靶位点测序、CNV分析和多能性验证），确保所得克隆适用于下游研究。相比传统方法，该技术将筛选工作量减少80%以上，且完全避免外源标记引入。特别值得注意的是，即使在非最优设计条件下（如ADNP案例），该方法仍展现出强大的筛选能力，这对罕见病研究尤为重要。

研究者同时指出，虽然传统CRISPR/Cas9仍受PAM序列限制，但通过系统优化可达到与新兴碱基编辑相当的效率（60% vs 64%）。该工作为干细胞基因编辑提供了可靠的技术路线图，其模块化设计也便于整合新型编辑器。未来结合单细胞测序等技术，有望进一步推动精准医学研究的发展。