基于重组酶聚合酶扩增与侧向层析技术(RPA-LFA)的IMO标准海洋病原菌快速检测方法开发

为解决压载水中IMO标准病原菌检测设备复杂、耗时长的问题，研究人员开发了结合重组酶聚合酶扩增(RPA)和侧向层析(LFA)的快速检测技术，成功实现37°C条件下20分钟完成V. cholerae、E. faecalis和E. faecium的高特异性检测，为海洋病原体现场监测提供新方案。

　　

海洋运输是全球贸易的命脉，每年约100亿吨压载水在船舶间转移，这些水体中潜藏着3×10²¹
量级的细菌，包括国际海事组织(IMO)重点监控的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(E. faecium)。这些病原体不仅威胁海洋生态，更可能通过压载水排放引发公共卫生危机。然而传统检测方法依赖PCR等复杂技术，需昂贵设备和数日周期，难以满足港口快速检疫需求。

针对这一技术瓶颈，来自韩国海洋科学技术院的研究团队在《The Microbe》发表创新成果，开发出基于重组酶聚合酶扩增(RPA)与侧向层析试纸条(LFA)的联用技术。研究通过设计特异性引物探针系统，优化37°C恒温反应条件，结合CD样生物芯片实现自动化检测，仅需1小时即可完成病原体筛查。

关键技术包括：1) 针对ctxB/ddl基因设计带FAM/生物素标记的RPA引物探针；2) 使用合成DNA模板替代活菌进行安全实验；3) 建立30-50°C温度梯度与0-30分钟时间梯度的反应优化体系；4) 开发集成反应腔、废液腔和LFA检测区的CD样生物磁盘。

研究结果显示，37°C反应20分钟为最佳条件，LFA可在5-10分钟内可视化结果。灵敏度测试证实可检测300ng以下DNA模板，特异性实验表明与V. barjaei等近缘菌种无交叉反应。创新的CD-LFA设计实现"样本进-结果出"的一体化检测，电泳验证显示废液腔回收的扩增产物条带清晰。

该研究突破性地将RPA-LFA技术应用于海洋病原体监测领域，其价值体现在三方面：首先，摆脱对热循环仪的依赖，使检测成本降低90%；其次，将传统48小时的检测周期压缩至1小时，满足IMO对压载水实时监测的要求；最后，CD-LFA设计为现场检测提供标准化操作方案。研究者特别指出，该方法虽未纳入E. coli检测以避免nfo酶干扰，但为Enterococcus spp.建立了首个RPA-LFA检测标准，填补了该领域技术空白。未来研究需进一步验证实际水样中的检测效能，并扩展至其他海洋病原体的筛查体系。