新型L-天冬酰胺酶的发现：基于宏基因组学、分子对接和分子动力学模拟揭示其抗癌潜力

本研究通过宏基因组分析从印度特里普拉邦发酵竹笋中鉴定出6个高质量宏基因组组装基因组(MAGs)，发现其中Paucilactobacillus vaccinostercus DBMD来源的L-天冬酰胺酶(ASNase)与底物L-天冬酰胺(L-asparagine)具有最高结合亲和力(-8.5 kcal/mol)和稳定性(RMSD 0.26±0.034 nm)，其结合自由能(-190.28 kJ/mol)显著优于商业酶Elspar(-12.47 kJ/mol)。研究为开发新型抗癌酶制剂提供了理论依据，同时揭示了传统发酵食品作为益生菌和功能酶资源库的重要价值。

　　

在喜马拉雅山区的尼泊尔、不丹和印度东北部，发酵竹笋制品是当地居民世代相传的传统食品。这些通过自然发酵制成的食品不仅风味独特，更蕴含着丰富的微生物资源。然而，这些"舌尖上的微生物宝库"中究竟藏着哪些"好菌"，它们又能为人类健康带来哪些惊喜？这成为科学家们亟待探索的课题。尤其值得注意的是，急性淋巴细胞白血病(ALL)作为儿童最常见的恶性肿瘤，其治疗面临重大挑战——目前临床使用的L-天冬酰胺酶(ASNase)主要来源于大肠杆菌，存在免疫原性高、稳定性差等问题。

来自中国的研究团队将目光投向了印度东北部特里普拉邦的传统发酵竹笋制品。通过先进的宏基因组学技术，研究人员从这些天然发酵食品中挖掘出6个高质量的宏基因组组装基因组(MAGs)，其中包括已知的益生菌如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，以及潜在的新兴益生菌如意大利肠球菌(Enterococcus italicus)和疫苗稀少乳杆菌(Paucilactobacillus vaccinostercus)。

研究采用了一系列前沿的生物信息学方法：通过MetaSPAdes进行宏基因组组装，使用MAXBIN 2.0进行基因组分箱；利用分子对接技术评估L-天冬酰胺酶与底物的结合特性；采用GROMACS 2023.2软件进行100 ns的分子动力学(MD)模拟，分析酶-底物复合物的稳定性；通过MM-PBSA方法计算结合自由能；并运用多种生物信息学工具对酶的免疫原性进行全面评估。

研究结果部分：

4.1 组装的基因组数据分离
从3218个DBMD支架中鉴定出12个分类箱，最终筛选出3个高质量MAGs（完整性≥90%，污染≤10%）。

4.2 分箱基因组的分类学鉴定
通过16S rRNA基因分析，鉴定出6个高质量MAGs，包括疫苗稀少乳杆菌DBMD、意大利肠球菌DBMD等，ANI值在89.14%-98.75%之间。

4.3 MAGs的功能注释
4.3.1 基因挖掘和MAGs的生物功能
发现63个与益生功能相关的假定基因，18个免疫调节基因，2个抗肿瘤基因等。所有MAGs均含有编码L-天冬酰胺酶的asnA/asnB基因。

4.3.2 MAGs的预测功能
KEGG分析显示73.56%的ORFs与代谢相关，L-天冬酰胺酶属于丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路(EC 6.3.1.1)。

1. 分子对接分析
   疫苗稀少乳杆菌DBMD的L-天冬酰胺酶显示最高结合亲和力(-8.5 kcal/mol)，形成7个氢键和1个疏水相互作用，显著优于商业酶Elspar(-4.2 kcal/mol)。

2. MD模拟分析
   6.1 RMS偏差
   疫苗稀少乳杆菌DBMD复合物RMSD最低(0.26±0.034 nm)，表明结构最稳定。

6.2 RMS波动分析
疫苗稀少乳杆菌DBMD复合物RMSF值最低(0.131 nm)，显示活性位点波动最小。

6.3 回转半径
疫苗稀少乳杆菌DBMD复合物Rg值(2.047-2.059 nm)显著低于其他(p<0.05)，结构最紧凑。

6.4 分子间氢键分析
疫苗稀少乳杆菌DBMD复合物平均形成2.38个氢键，稳定性最佳。

6.7 MM-PBSA计算
疫苗稀少乳杆菌DBMD结合自由能(-190.28 kJ/mol)显著优于意大利肠球菌DBMD(-48.16 kJ/mol)和Elspar(-12.47 kJ/mol)。

1. L-天冬酰胺酶的免疫原性分析
   疫苗稀少乳杆菌DBMD来源的L-天冬酰胺酶抗原性评分最低(0.336)，无过敏原性(AllerTOP评分-0.489)，且磷酸化位点(24个)少于Elspar(34个)。

这项研究首次从传统发酵竹笋中系统挖掘出具有双重功能潜力的微生物资源——既可作为优质益生菌，又能提供高性能的L-天冬酰胺酶。特别值得注意的是，疫苗稀少乳杆菌DBMD来源的L-天冬酰胺酶展现出超越商业标准Elspar的卓越性能：更高的底物亲和力、更稳定的酶-底物复合物结构、更强的结合自由能，以及更低的免疫原性风险。这些发现不仅为开发新一代抗癌酶制剂提供了优质候选，也为传统发酵食品的深度开发和价值提升开辟了新思路。

研究的创新性体现在多个维度：首次对印度东北部特里普拉邦发酵竹笋中的MAGs进行全面解析；首次对乳酸菌来源的L-天冬酰胺酶进行系统性的计算机辅助分析；首次发现疫苗稀少乳杆菌可作为高性能L-天冬酰胺酶的新来源。这些突破性发现为食品微生物资源的开发利用提供了全新视角，也为解决当前抗癌酶制剂面临的免疫原性高、稳定性差等临床难题提供了潜在解决方案。

当然，这项以生物信息学为主的研究还需要后续实验验证。未来研究可着重于：这些L-天冬酰胺酶的体外表达和活性验证；其在不同生理条件下的稳定性测试；以及临床前安全性评估等。此外，这些MAGs中其他功能基因（如免疫调节、抗氧化相关基因）的开发价值也值得深入探索。