灰葡萄孢菌犬尿氨酸酶通过犬尿氨酸途径调控病原菌生长、发育及致病性的分子机制研究

本研究首次在灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)中发现犬尿氨酸(KYNU)代谢通路，通过构建BcKYNL1/BcKYNL2基因敲除突变体，揭示该通路通过调控关键代谢物喹啉酸(QA)含量影响病原菌生长、致病力及胁迫响应。分子对接和表面离子共振证实BcKYNL1/BcKYNL2分别特异性作用于KYNU和3-羟基犬尿氨酸(3-HK)，为开发新型杀菌靶点提供理论依据。

　　

灰葡萄孢菌是引起1000多种作物灰霉病的典型坏死营养型病原真菌，其分生孢子在15-23°C潮湿环境中极易传播，造成严重采后损失。目前防治主要依赖化学杀菌剂，但由于该菌遗传变异快、适应性强，已对多种作用机制的杀菌剂产生抗性。随着B05.10和T4菌株基因组测序完成，灰葡萄孢菌成为研究病原体-宿主互作的重要模式生物。犬尿氨酸途径(KYNU)作为色氨酸分解代谢的主要通路，在哺乳动物中参与神经系统疾病、自身免疫疾病等重要病理过程，但此前在植物病原真菌中的功能未见报道。

河北农业大学植物生理与分子病理学重点实验室的研究团队通过生物信息学分析获得灰葡萄孢菌KYNU通路相关基因BcIDO、BcKFA、BcHAO、BcKYN、BcKMO和BcKAT。研究发现BcKYNL1和BcKYNL2基因突变体正向调控灰葡萄孢菌的生长、致病性和胁迫响应。代谢组分析显示突变体中色氨酸代谢相关产物含量显著改变，外源添加喹啉酸(QA)可部分恢复突变体致病性。该成果发表于《Microbiological Research》，揭示了KYNU通路通过代谢物含量调控病原菌致病性的新机制。

研究采用生物信息学鉴定KYNU通路关键基因，构建基因敲除突变体（△BcKYNL1/△BcKYNL2）及回补菌株；通过表型分析、致病性测定评估突变体特征；利用靶向代谢组学测定KYNU通路关键代谢物；结合分子对接和表面等离子共振技术分析蛋白-配体互作；采用荧光淬灭光谱验证结合特性。

研究结果：
3.1 KYNU通路参与灰葡萄孢菌生长发育及致病过程
系统鉴定出灰葡萄孢菌KYNU通路的18个关键酶基因，构建的△BcKYNL1/△BcKYNL2突变体菌丝变细、生长速率降低且不产生菌核。致病性分析显示突变体病斑面积显著小于野生型，证实KYNU通路参与病原菌生命活动调控。

3.2 犬尿氨酸酶调控灰葡萄孢菌生长发育
△BcKYNL1突变体生长速率显著减慢，△BcKYNL2菌丝细胞长度增加但宽度减小，回补菌株恢复菌核形成能力，表明BcKYNL1/BcKYNL2通过影响菌丝形态调控发育。

3.3 BcKYNL1/BcKYNL2正向调控致病性
烟草接种实验显示突变体病斑面积减少50%以上，回补菌株恢复野生型表型，证明KYNU酶是灰葡萄孢菌致病关键因子。

3.4 调控侵染垫形成及细胞壁降解酶活性
△BcKYNL1侵染垫数量减少而△BcKYNL2增多，但尺寸均变小。突变体产酸能力减弱，果胶酶/纤维素酶活性异常，相关基因表达显著改变。

3.5 参与胁迫响应调控
△BcKYNL1在NaCl、刚果红等胁迫下生长恢复，△BcKYNL2对氧化胁迫敏感，提示基因参与Na⁺
稳态和细胞完整性调控。

3.6 影响KYNU通路代谢物水平
△BcKYNL1中KYNU和QA含量降低，△BcKYNL2中色氨酸、KYNA等积累。外源QA可恢复△BcKYNL1致病性，证实QA是致病关键效应分子。

3.7 特异性结合KYNU和3-HK
分子对接发现BcKYNL1关键结合位点为Glu62/Arg64，BcKYNL2为Tyr202/Glu203等。表面等离子共振显示BcKYNL2与3-HK结合亲和力达48nM，确立BcKYNL2-BcKMO分支为KYNU代谢主通路。

该研究首次阐明灰葡萄孢菌KYNU通路的完整代谢网络，揭示BcKYNL1/BcKYNL2通过分解KYNU和3-HK调控NAD⁺
合成，影响病原菌能量代谢和致病过程。发现QA作为通路终产物直接决定致病力强弱，为开发靶向KYNU通路的新型杀菌剂提供理论支撑。研究还发现色氨酸代谢与5-羟色胺系统、细菌降解途径存在交叉调控，为理解微生物代谢网络互作提供新视角。这些发现不仅对防治灰霉病具有应用价值，也为研究其他植物病原真菌致病机制建立范式。