基于自动切除系统的副猪格拉菌高效基因编辑技术开发及应用

本研究针对细菌基因编辑中传统方法耗时耗力、需多次转化及标记去除繁琐等问题，开发了Auto-Excision (AE)系统。通过整合Flp-FRT和Cre/loxP重组系统，实现了副猪格拉菌(Glaesserella parasuis)单次转化即可完成90%以上效率的基因敲除，并将全流程缩短至1天。该系统支持多基因连续编辑，为病原机制研究和疫苗开发提供了高效工具。

　　

在细菌遗传学研究中，高效精准的基因编辑技术是解析病原体致病机制的关键。然而，传统方法如Flp-FRT和Cre/loxP系统虽广泛应用，却面临质粒构建繁琐、需多次转化及标记基因去除耗时等瓶颈。这些问题在副猪格拉菌(G. parasuis)等具有自然转化能力的病原体中尤为突出，严重制约了多基因功能研究的效率。

针对这一挑战，西藏自治区科技计划等项目支持下的研究团队在《Microbiological Research》发表成果，开发了革命性的Auto-Excision (AE)系统。该系统通过三步优化策略：采用PCR直接获取靶序列替代质粒构建、单次自然转化实现基因编辑、利用瞬时抗性表达筛选无标记突变体，将操作时间压缩至1天，且连续成功敲除5个基因。

关键技术包括：1) 基于自然转化机制的DNA递送；2) Flp/FRT和Cre/loxP重组系统的协同应用；3) 抗性标记的自动切除设计。实验采用副猪格拉菌CF7066株(CCTCC AB 2021003)及大肠杆菌DH5α，在含NAD和牛血清的TSB培养基中培养。

【Auto-excision策略】
研究发现单链DNA在自然转化过程中可能阻碍转录和重组，AE系统通过优化重组酶表达时序，使抗性基因仅在转化初期短暂表达，后续通过自身启动子驱动重组酶完成自动切除。

【讨论】
该系统突破性地将操作时间缩短至单个菌落生长周期，效率超90%。其核心创新在于：靶片段通过PCR与重组酶体外组装，避免质粒构建；抗性基因的瞬时表达特性使得在抗生素压力下仍能筛选无标记突变体。这种"边转化边切除"的设计，尤其适合流感嗜血杆菌等具有自然转化能力的病原体。

该研究不仅为G. parasuis的毒力因子研究提供利器，其普适性设计更可推广至80余种具有自然转化能力的细菌。相比CRISPR-Cas9等系统，AE系统在操作简便性和多基因编辑效率上展现显著优势，为细菌基因组规模化改造建立了新范式。作者团队特别指出，该系统在疫苗减毒株构建和抗生素靶点验证方面具有重要应用前景。