基于空间位阻扫描策略的β-葡萄糖苷酶BgMd活性改造及其在糖苷转化中的应用

本研究针对β-葡萄糖苷酶(BgMd)催化效率不足的问题，通过创新性空间位阻扫描策略，成功获得活性显著提升的突变体E329K/R72N/A94H/T135H（26.1倍提升），并实现多种糖苷（如polydatin、ginsenoside Rb1 、astragaloside）的高效转化（转化率最高达96.23%）。该研究为糖苷类药物的绿色制备提供了新思路。

　　

糖苷类化合物广泛存在于植物中，其糖基水解产物往往具有更高的药用价值。然而，传统化学水解工艺存在环境污染大、条件苛刻等问题，而天然β-葡萄糖苷酶的催化效率常难以满足工业化需求。针对这一瓶颈，江苏大学的研究团队在《Molecular Catalysis》发表了一项突破性研究。

研究采用空间位阻扫描（steric hindrance scanning）这一创新策略，对来源于Microbacterium dextranolyticum的β-葡萄糖苷酶BgMd进行改造。通过引入不同侧链大小的氨基酸构建突变库，结合分子对接（molecular docking）和分子动力学（MD）模拟分析，最终获得活性显著提升的突变体。

关键技术包括：1）基于序列比对筛选6种β-葡萄糖苷酶；2）空间位阻扫描构建单点突变体；3）迭代组合优化获得四突变体E329K/R72N/A94H/T135H；4）采用HPLC测定polydatin等底物转化率；5）分子模拟解析突变体催化机制。

【材料与方法】
研究选取BgMd等6种β-葡萄糖苷酶进行表达纯化，以pNPG（对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷）为底物筛选最优酶。通过引入丙氨酸、组氨酸等5种氨基酸构建空间位阻突变库，筛选获得6个活性提升的单突变体。

【结果与讨论】

1. 突变体性能：最优四突变体对polydatin的水解时间缩短50%，转化率提升至95.93%；A94T/V336T突变体使ginsenoside Rb₁
   转化率从26.94%提升至76.38%；E329N突变体对astragaloside的转化率达96.23%。
2. 酶学特性：突变体最适温度50-60°C、pH 7.0，部分突变体热稳定性显著增强。
3. 机制解析：MD模拟显示突变导致底物口袋分裂为两个区域，相互作用能降低，与活性提升正相关。

该研究不仅证实空间位阻扫描是有效的蛋白工程策略，更实现了多种高价值糖苷的高效生物转化。突变体在保留野生型稳定性的同时，催化效率显著提升，为糖苷类药物绿色制造提供了新工具。研究还揭示了β-葡萄糖苷酶底物特异性调控的结构基础，为后续理性设计提供了重要参考。