艰难梭菌生物膜基质中胞外DNA丝与表面多糖II相互作用形成的网络状结构解析

本研究针对艰难梭菌(Clostridioides difficile)生物膜基质的关键结构开展深入解析，首次发现胞外DNA(eDNA)丝与表面多糖II(PSII)、脂蛋白CD1687的相互作用共同构建了"蜘蛛网"状三维网络结构。通过比较四种不同生物膜形成能力的菌株（包括临床株R20291和实验室株630△erm及其突变体），结合共聚焦显微镜和原子力显微镜技术，揭示了eDNA丝作为生物膜支架的核心作用，其与PSII、CD1687的共定位显著增强了生物膜粘附性和结构稳定性，为理解艰难梭菌复发感染机制提供了新视角。

　　

在医疗相关感染中，艰难梭菌(Clostridioides difficile)引发的肠道疾病因其高复发率成为临床难题。尽管孢子被认为是复发的主要储存库，但越来越多的证据表明，生物膜可能在抗生素治疗后的持续感染中扮演关键角色。这种由细菌群体分泌的胞外基质构成的保护性结构，能够抵抗宿主免疫和药物攻击，但其具体组成和三维架构在艰难梭菌中仍不明确。特别是在生物膜基质中，各种胞外聚合物(EPS)如何协同作用形成稳定结构，成为理解复发机制的重要突破口。

来自法国巴黎萨克雷大学的研究团队在《npj Biofilms and Microbiomes》发表的研究中，通过多学科技术揭示了艰难梭菌生物膜基质的精细结构。研究采用四种代表性菌株（包括高生物膜产株630△erm△cwp84和630△erm△fliC），结合共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)三维成像、原子力显微镜(AFM)表面拓扑分析、基质成分定量检测以及特异性降解实验，首次可视化eDNA丝的网络结构，并阐明其与PSII、CD1687的相互作用机制。

异质性的艰难梭菌体外生物膜结构

通过结晶紫染色定量和显微镜技术，研究证实四种菌株均能形成具有独特三维结构的生物膜，其中630△erm△cwp84突变体形成的生物膜最厚（32±10μm），生物量是亲本株的7倍。CLSM显示活菌主要分布在生物膜顶部，而死菌聚集在基底。AFM揭示不同菌株生物膜表面形貌差异显著，630△erm△cwp84表面可见明显杆菌结构，而其他菌株则呈现"鹅卵石"状纹理。

胞外基质成分介导的生物膜凝聚力

基质成分定量显示，多糖（76-89%）是主要组分，其次是蛋白质（8-20%）和eDNA（4-7%）。尽管eDNA含量最低，但DNase I处理导致高生物膜产株630△erm△cwp84和630△erm△fliC的生物量分别减少81%和70%，表明eDNA在维持结构完整性中起关键作用。蛋白水解酶仅对630△erm株有显著影响，而多糖氧化剂NaIO₄
无破坏效果，提示不同EPS成分的功能特异性。

生物膜基质成分的空间分布

CLSM首次捕捉到eDNA丝连接细菌形成"蜘蛛网"状网络的精细结构，这种网络在630△erm△cwp84突变体中最密集。双染色实验显示PSII和CD1687与eDNA丝存在共定位：

• PSII沿eDNA丝分布（除630△erm△fliC外），在R20291中还形成独立网络
• CD1687在630△erm△cwp84基质中形成与eDNA丝关联的大簇
• 脂质标记发现直径400-2000 nm的囊泡样结构可能参与EPS运输

基质成分的释放机制

自溶实验显示630△erm△cwp84自溶速率快于亲本株，但删除自溶素基因cwp19不影响生物膜形成，表明自溶并非EPS释放的主要途径。FM4-64标记的囊泡样结构提示主动分泌可能是重要机制。

该研究突破性地揭示了eDNA丝作为艰难梭菌生物膜"骨架"的核心地位，其与PSII、CD1687的协同作用解释了高生物膜产株的结构稳定性。这些发现为理解生物膜在复发感染中的作用提供了分子基础：

1. eDNA丝的拓扑结构（而非绝对含量）决定生物膜凝聚力
2. PSII和CD1687通过稳定eDNA网络增强结构完整性
3. 表面蛋白Cwp84缺失通过改变S层结构促进CD1687释放和囊泡形成
4. 鞭毛缺失可能通过改变细菌表面特性影响PSII释放

这些发现不仅深化了对艰难梭菌生物膜生物学的认识，还为针对基质成分（如eDNA-PSII-CD1687复合体）的精准干预策略提供了理论依据，对开发预防复发的新型抗感染疗法具有重要指导价值。