miR-26a-5p通过抑制Smad4恢复ALS肌细胞成肌分化能力及其对运动神经元发育的影响

本研究揭示了肌萎缩侧索硬化症（ALS）中骨骼肌卫星细胞通过分泌miRNAs（如miR-26a-5p、-134-5p和-882）调控成肌分化的新机制。研究发现，野生型肌细胞分泌的miR-26a-5p可被ALS（hSOD1G93A ）肌细胞摄取，通过靶向抑制Smad4信号通路恢复其分化能力，同时促进运动神经元（MN）突触生长。该成果为ALS的"肌肉中心"病理假说提供了实验依据，并提出了基于miRNA的潜在治疗策略。

　　

ALS肌细胞成肌分化障碍的分子机制
研究团队发现，源自hSOD1^G93A
转基因小鼠的原代肌细胞（PCM）表现出显著的成肌分化缺陷。通过蛋白质印迹分析显示，胚胎型肌球蛋白重链（EmbMyHC）、生肌调节因子（MRFs）如Pax7、MyoD和肌生成素的表达量显著降低。关键信号通路p38MAPK和蛋白激酶A（PKA）/pCREB的磷酸化水平异常，导致细胞周期抑制蛋白p21表达下降，揭示了ALS肌细胞内在分化障碍的分子基础。

细胞间通讯的拯救效应
采用Transwell共培养系统证实，野生型（hSOD1^WT
）肌细胞分泌的因子可显著改善hSOD1^G93A
肌细胞的分化表型。定量分析显示，共培养组的肌管面积增加2.3倍，融合指数提升1.8倍。通过时序实验确认，这种拯救效应依赖于早期（2天内）分泌的活性物质，暗示miRNAs可能作为关键信号分子发挥作用。

miRNA分泌谱的特征解析
微阵列分析鉴定出492种分泌型miRNAs，其中53种存在基因型依赖性差异。hSOD1^WT
肌细胞优先分泌miR-26a-5p、-324-5p和-431-5p（促进分化簇），而hSOD1^G93A
肌细胞过量分泌miR-28a-3p、-882和-134-5p（抑制分化簇）。RT-qPCR验证显示，miR-26a-5p在野生型培养基中的浓度比突变型高3.2倍，这种差异与肌细胞分化能力呈正相关。

关键miRNA的靶向调控网络
双荧光素酶报告基因实验证实：

• miR-134-5p直接靶向^Cre
  b1 3'UTR，抑制PKA信号传导
• miR-882同时作用于^Pax7
  和^MyoD1
  mRNA
• miR-26a-5p通过结合^Igfbp5
  和^Smad4
  mRNA调控肌肉再生
  染色质免疫沉淀（ChIP）实验进一步揭示，miR-26a-5p上调导致Smad4在靶基因（^Id1
  、^Lgr5
  和^Kif7
  ）启动子区的占据率下降40%-60%，从表观遗传层面阐释了其促分化机制。

神经-肌肉双向调控的发现
条件培养基实验显示，hSOD1^G93A
肌细胞分泌组使运动神经元突触长度缩短35%，而过表达miR-26a-5p的培养基可逆转此效应。值得注意的是：

• miR-26a-5p转染使MN突触分支数量增加2.1倍
• miR-431-5p协同促进突触延伸（长度增加42%）
• miR-134-5p对神经突生长无显著影响
  这种跨组织调控效应揭示了神经肌肉系统在ALS中的双向通讯模式。

跨模型验证与治疗潜力
在FUS转基因小鼠模型中，快肌纤维富集的胫骨前肌（TA）和腓肠肌（GAS）同样表现出miR-26a-5p下调（约2.5倍）和Smad4上调（1.8倍），提示该机制可能具有跨ALS基因型的普适性。研究者提出，基于miR-26a-5p的基因治疗或外泌体递送策略，可能同时改善ALS患者的肌肉再生和神经保护，为开发新型联合疗法提供了理论依据。