基于基因组与实验分泌组学的苏云金芽孢杆菌信号肽筛选及异源蛋白分泌系统构建

这篇研究通过整合基因组预测（SignalP 5.0/PSORTb 3.0）和LC-MS/MS实验验证，首次系统表征了苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HD73的分泌组，构建含30个信号肽（SPs）的文库，并利用无晶体突变株HD73? 实现绿色荧光蛋白（GFP）和角质酶（cutinase）的高效分泌（最高活性3.65 U/mL），为工业酶和生物医药蛋白生产提供了新型宿主系统。

　　

基因组与实验分泌组学揭示苏云金芽孢杆菌的分泌潜力

摘要
研究团队通过生物信息学预测结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，首次全面解析了苏云金芽孢杆菌HD73的分泌组特征。基因组分析预测出525个含信号肽的蛋白质，远超其他芽孢杆菌属物种；实验验证鉴定到100种实际分泌蛋白。基于此构建的30个信号肽文库，在无晶体突变株HD73^?
中成功实现GFP和角质酶的高效分泌，其中S17-GFP系统分泌效率最优，而S20-角质酶融合株活性达3.65 U/mL。该研究为工业酶和生物制剂生产提供了新的底盘细胞选择。

材料与方法
实验采用HD73野生株及其无晶体突变株HD73^?
作为宿主，通过SignalP 5.0预测Sec型（322个）、Lipo型（200个）和Tat型（3个）信号肽。分泌蛋白在5个生长阶段（T_?1
至T₂₁
）通过两步离心和0.22 μm过滤收集，经SDS-PAGE和LC-MS/MS鉴定。利用pHT315载体构建含P_cry8E
启动子的分泌系统，通过重叠PCR无缝连接信号肽与报告基因。

结果

1. 分泌组特征：实验分泌组中36%为水解酶类，13%为杀虫毒素蛋白。磷脂酶C（HD73_0751）等3种蛋白在所有时间点均被检出，提示其基础分泌功能。
2. 信号肽文库效能：27个SP-GFP融合体中，S17在30 h时相对荧光强度显著高于其他SP（p<0.05），而角质酶分泌中S20表现最优，显示SP-靶蛋白特异性。
3. 启动子比较：孢子形成依赖型启动子P_cry8E
   的分泌效率显著高于组成型启动子P_A3
   和过渡期启动子P_sip
   。

讨论
与枯草芽孢杆菌168相比，HD73的预测分泌蛋白数量（525 vs 406）和实验验证分泌蛋白（100 vs 90）均具优势。然而，培养上清中检测到的21种蛋白酶可能影响异源蛋白稳定性，未来需构建蛋白酶缺陷株（如aprA/nprA双敲除）以优化系统。该研究不仅填补了苏云金芽孢杆菌分泌组学空白，其信号肽文库更为定向改造工业菌株提供了模块化工具。