基于五氟苯丙基功能化色谱柱增强LC-MS分离的非靶向亲水性代谢物分析及预测型MS/MS谱图注释

本研究创新性地采用五氟苯丙基功能化色谱柱（PFP column）结合液相色谱-质谱联用技术（LC-MS），显著提升了亲水性代谢物的保留与分离效果，并开发了基于预测MS/MS谱图相似性搜索的注释方法。通过48种标准品验证，结构注释准确率达54%，生物相关性分类准确率超70%，在番茄果实分析中成功注释1116个代谢峰，为全面解析亲水性代谢组（包括初级和次级代谢物）提供了高效技术方案。

　　

1 引言
非靶向代谢组学技术自酵母代谢组研究（1998年）以来，已广泛应用于哺乳动物、植物和微生物研究领域。然而，亲水性代谢物（包括初级和次级代谢物）的全面分析仍面临两大挑战：色谱分离技术局限和注释方法不足。传统反相色谱（RP）对亲水性代谢物保留弱，而亲水相互作用色谱（HILIC）和离子交换色谱（IEX）存在添加剂浓度高、平衡时间长等问题。五氟苯基色谱柱（PFP column）因其独特的π-π相互作用和氢键能力，有望实现亲水性代谢物的高效分离。

2 方法
2.1 色谱优化
采用Discovery HS F5 PFP色谱柱（3 μm，150×2.1 mm），以含0.1%甲酸（FA）和10 mM甲酸铵（AF）的甲醇/水体系为流动相，梯度洗脱程序优化至35分钟。对比普通ODS柱，PFP柱使19种弱保留化合物的保留时间平均延长2.3倍，且含三级胺结构的生物碱类化合物峰形改善显著。

2.2 注释流程
整合HMDB、LOTUS和MassBank数据库，通过RDKit标准化SMILES字符串。采用CFM-ID 4.0预测缺失的MS/MS谱图，基于光谱熵算法计算实验与预测谱图相似性（阈值>0.4）。通过NP Classifier将注释结果按天然产物路径分类，涵盖氨基酸、生物碱等8大类。

3 结果
3.1 色谱性能提升
PFP柱在含10 mM AF的甲醇体系中，使番茄提取物中同位素标记代谢物（如¹³
C₃
-丙氨酸）的保留时间从ODS柱的1.2分钟延长至4.5分钟，峰面积RSD从28%降至12%。48种标准品中，分子式注释准确率达94%，结构注释准确率54%（忽略立体异构），其中70%以上注释在NP Class层面具有生物学意义。

3.2 番茄代谢组应用
在番茄果实中检出658（正离子模式）和458（负离子模式）个注释峰，显著多于既往报道的208个代谢物。NP分类显示正离子模式富集氨基酸/生物碱（占62%），负离子模式富集碳水化合物/脂肪酸（占57%）。两种番茄品种的差异代谢物主要集中于香豆素类和苯丙烷类通路。

4 讨论
PFP柱通过π-π和偶极相互作用增强亲水代谢物保留，而10 mM AF的添加有效抑制了碱性化合物的峰拖尾。MS/MS预测注释虽在阳离子代谢物（如胆碱衍生物）中存在局限，但NP分类框架为功能解析提供了新视角。该方法无需物种特异性数据库即可实现跨物种代谢组深度覆盖。

5 结论
该研究建立的PFP-LC-MS联用技术与预测型注释流程，为亲水性代谢物的非靶向分析提供了标准化方案，在植物代谢工程和疾病标志物筛查等领域具有广泛应用前景。未来需进一步优化MS/MS碎裂规则以提高阳离子代谢物注释精度。