基于Myomedin变体的PD-L1体外诊断技术在非小细胞肺癌组织样本中的应用研究

本研究针对非小细胞肺癌(NSCLC)患者免疫检查点阻断疗法(ICB)的疗效预测需求，通过定向进化技术开发了靶向PD-L1的高亲和力Myomedin变体(MLE)。研究人员利用核糖体展示筛选技术，从13 kDa Myomedin环型组合库中筛选出7种特异性结合人PD-L1(hPD-L1)的蛋白变体，并通过ELISA、LigandTracer动力学分析及免疫荧光验证其结合特性。结果显示，MLE249和MLE309与临床诊断抗体DAKO 28-8和22C3在扁桃体和NSCLC组织中的染色重叠性优异(Pearson系数分别达0.836和0.876)。进一步构建的MLE-rFc融合蛋白在Ventana免疫组化系统中展现出比金标准抗体更高的敏感性。该研究为PD-L1诊断提供了新型非免疫球蛋白工具，有望优化NSCLC患者的治疗决策。论文发表于《Journal of Translational Medicine》。

　　

在癌症治疗领域，免疫检查点阻断疗法(Immune Checkpoint Blockade, ICB)通过靶向程序性死亡配体1(Programmed Death-Ligand 1, PD-L1)及其受体PD-1，已成为非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Carcinoma, NSCLC)的重要治疗策略。然而，临床实践中PD-L1表达的检测仍面临挑战：现有诊断抗体如DAKO 28-8和22C3存在灵敏度差异，且价格昂贵。更棘手的是，肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)中PD-L1的异质性表达和糖基化修饰可能导致假阴性结果，直接影响患者对ICB疗法的响应预测。

为解决这一难题，捷克科学院生物技术研究所联合帕拉茨基大学的研究团队另辟蹊径，选择了一种非抗体结合蛋白——源自人类收缩蛋白myomesin-1第10结构域的Myomedin作为分子支架。通过定向进化技术，研究人员构建了包含12个随机氨基酸残基的β-片层组合库，理论复杂度高达10¹⁵
种变异体。借助核糖体展示技术，他们从库中筛选出7种高亲和力PD-L1结合蛋白(MLE031/098/105/249/264/270/309)，其核心创新在于将13 kDa的小分子优势与抗体的特异性完美结合。

研究团队采用多维度技术验证MLE变体的性能：通过ELISA测定结合曲线显示所有候选蛋白均能特异性识别重组PD-L1-Fc；LigandTracer实时动力学分析揭示MLE105对hPD-L1的平衡解离常数(KD)低至7.59 nM；免疫荧光证实这些变体可精准定位到转染PD-L1的HEK293T细胞和经IFN-γ/TNF-α刺激的MCF-7癌细胞膜表面。尤为关键的是，在扁桃体组织切片中，MLE309与临床金标准抗体22C3的染色重叠率高达87.6%，而MLE249与28-8抗体的Pearson系数达到0.836。

主要技术方法

研究采用核糖体展示进行五轮体外筛选，通过ELISA初筛125个克隆；使用LigandTracer Green测定蛋白-靶标相互作用动力学；在HEK293T细胞中瞬时表达人/鼠PD-L1进行特异性验证；对10例NSCLC患者的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本进行免疫荧光和免疫组化分析；构建MLE-rabbit IgG-Fc(rFc)融合蛋白适配常规诊断系统。

研究结果

PD-L1靶向MLE变体的筛选
从核糖体展示获得的256个克隆中鉴定出54个正确序列，ELISA结合曲线显示7个变体(如MLE249)对PD-L1的半数有效浓度(EC₅₀
)低于100 nM。竞争ELISA发现MLE105和MLE270能阻断PD-1/PD-L1相互作用，提示其潜在治疗价值。

细胞表面PD-L1的结合验证
在hPD-L1-HEK293T细胞中，所有MLE变体均显示膜定位信号，与商用抗PD-L1抗体共定位。经IFN-γ/TNF-α刺激的MCF-7细胞中，MLE309染色强度提升3倍，证实其对诱导型PD-L1的响应能力。

跨物种反应性分析
MLE249和MLE105对鼠源PD-L1(mPD-L1)的KD分别为18.2 nM和23.4 nM，这种交叉反应性为后续动物模型研究奠定基础。

组织水平的诊断验证
在NSCLC组织芯片中，MLE249-rFc检测到的阳性细胞数比22C3抗体多出15-49%，尤其在腺癌样本中显示出更清晰的膜染色模式。值得注意的是，在PD-L1低表达(<1%)的肿瘤10R中，MLE249-rFc仍检测到离散阳性信号，而22C3呈阴性。

结论与意义

该研究开创性地将Myomedin支架蛋白应用于PD-L1诊断领域，其开发的MLE变体具有三大突破：1)分子量仅为抗体的1/10，可能穿透肿瘤组织的物理屏障；2)对糖基化不敏感的特性有助于检测传统抗体遗漏的表位；3)大肠杆菌表达系统使生产成本降低80%。这些特性使MLE蛋白有望成为现有免疫组化检测的补充工具，特别适用于PD-L1表达临界值病例的判读。

正如通讯作者Petr Maly和Milan Raska强调的，下一步将开展千例以上前瞻性队列研究，验证MLE诊断结果与患者对pembrolizumab/nivolumab治疗响应的相关性。若临床转化成功，这种工程蛋白不仅可优化ICB疗法的人群筛选，其模块化设计更为其他免疫检查点分子(如CTLA-4、LAG-3)的诊断试剂开发提供了新范式。