空间表达模式引导的蛋白质配对与计算解混技术实现三维多重荧光成像能力倍增

韩国科学技术院团队开发SEPARATE技术，通过空间表达模式(SEP)引导的蛋白质配对和神经网络解混，实现单次染色中双蛋白共标记与信号分离。该研究解决了三维多重成像中染色周期长、信号重叠等难题，成功将六种蛋白成像所需的荧光染料减半，为神经科学和肿瘤异质性研究提供了重要工具。

　　

在探索复杂生物系统的道路上，科学家们长期面临着一个关键挑战：如何在三维空间中同时观察多种蛋白质的分布？这个问题在神经科学研究中尤为突出，因为大脑由上百种细胞类型精密组装而成，传统的二维成像技术只能捕捉片段化信息。更棘手的是，当研究者尝试对厚组织样本进行三维成像时，常规的循环免疫荧光方法需要重复进行染色-成像-信号清除的流程，单次染色就可能耗费12小时以上，使得对10种蛋白的成像需要数天时间。这种漫长的过程不仅效率低下，还会导致样本质量下降和抗原完整性受损。

韩国科学技术院的研究团队在《Communications Biology》发表的研究中，提出了一种革命性的解决方案——SEPARATE（空间表达模式引导的蛋白质配对与解混）技术。这项研究由Gyuri Kim和Young-Gyu Yoon领衔，通过巧妙结合深度学习与光学成像，实现了用三个荧光通道同时成像六种蛋白质的目标，将传统方法所需的染色周期直接减半。

研究团队采用了三个关键技术：首先开发了基于对比学习的特征提取网络，通过量化蛋白质空间表达模式的特征距离（feature-based distance）指导最优蛋白质配对；其次构建了三维U-Net架构的蛋白质分离网络，实现双蛋白混合信号的精准解混；最后创新性地采用合成图像训练策略，通过随机比例线性叠加单蛋白图像，使网络对信号强度差异具有鲁棒性。实验验证使用了小鼠海马齿状回区域的150μm厚切片，通过旋转盘共聚焦显微镜获取图像。

【SEPARATE：基于空间表达模式差异的蛋白质配对与解混】
研究团队首先证明，蛋白质空间表达模式的视觉差异是信号解混的关键。通过特征提取网络对10种蛋白（如calbindin 2、GFAP、NeuN等）的分析，发现核定位蛋白（nucleolin与NeuN）或纤维状蛋白（GFAP与doublecortin）在特征空间中形成紧密簇群。这种特征距离与后续解混性能呈显著正相关（Pearson相关系数0.7144），说明空间模式差异越大，解混效果越好。

【特征提取网络的预测能力验证】
通过对比最优分组（最小特征距离1.4609）与次优分组（最小距离0.9092），发现前者解混的结构相似性指数（SSIM）显著更高。特别值得注意的是，对固有相似蛋白（如NeuN与nucleolin）引入归一化性能指标后，特征距离与归一化SSIM的相关性提升至0.9404，证实该方法能有效控制空间分布相似性带来的干扰。

【特征距离的实验稳定性】
研究验证了该方法在不同样本（相关系数0.9923）、成像分辨率（binning≤16时相关系数>0.85）和噪声条件下（经去噪处理后相关系数≈0.9）的稳定性。蒙特卡洛模拟显示，当归一化特征距离>1.5时，SSIM能稳定保持在0.9以上。

【六蛋白体积多重成像演示】
最终实验演示中，研究团队根据特征距离将六种蛋白分为三组：（GFAP, NeuN）、（lamin B1, PV）和（doublecortin, nucleolin），分别用CF488A、CF568和CF633标记。在25μm成像深度内，蛋白质分离网络成功将混合信号解混，三维重建清晰展示了不同蛋白的空间分布。

【扩展验证与普适性】
使用艾伦研究所人类细胞数据集（含alpha-tubulin、ZO-1等10种蛋白）的验证表明，该方法跨物种适用性良好。与细胞膜配对的蛋白解混性能SSIM平均达0.7800，与DNA配对的达0.8825，证实技术在不同成像体系中的稳健性。

这项研究的突破性在于将深度学习与实验设计紧密结合，创造了"先评估后配对"的新范式。相比传统光谱成像需要采集与蛋白数量相当的窄带图像，SEPARATE仅需一半数量的宽带图像，显著提高了信噪比。虽然技术目前存在抗体空间位阻、低密度区域特征有限等局限，但其与现有循环成像技术的兼容性（如结合PICASSO方法）为未来扩展提供了可能。该技术不仅适用于神经科学研究，在肿瘤异质性分析、发育生物学等领域也具有广阔应用前景，为理解复杂生物系统的三维分子架构提供了强有力的新工具。