epsH基因缺失通过增强胞外基质促进海分枝杆菌生物膜形成与抗生素耐受性研究

本研究针对结核分枝杆菌(M. tuberculosis)生物膜介导的抗生素耐受性难题，通过构建海分枝杆菌(M. marinum)转座子突变库，发现糖基转移酶基因epsH缺失会显著增加胞外DNA(eDNA)和蛋白质含量，导致生物膜基质(ECM)增厚。该突变株在斑马鱼感染模型中表现出更强的抗生素耐受性，揭示了ECM组成调控在结核病治疗耐受中的关键作用，为靶向生物膜基质的辅助疗法开发提供新思路。

　　

结核病(TB)至今仍是全球最致命的传染病之一，世界卫生组织2024年报告显示其年死亡人数达125万。尽管现有四联疗法可治愈结核病，但长达6个月的治疗周期暴露出病原体结核分枝杆菌(M. tuberculosis)惊人的耐受能力。近年研究发现，这种耐受性与细菌生物膜形成密切相关——这些由胞外基质(ECM)包裹的细菌群落已在患者肺组织中被证实存在，其基质成分能像"防护罩"般阻挡抗生素渗透。然而，调控这一"防护罩"形成的关键分子机制仍属未知。

为破解这一难题，来自Tampere University等机构的研究团队选择结核分枝杆菌的近缘种——海分枝杆菌(M. marinum)作为模型，通过创新性的遗传筛选和动物实验，首次揭示糖基转移酶EpsH通过调控胞外DNA(eDNA)沉积影响生物膜基质的分子机制。这项发表于《npj Biofilms and Microbiomes》的研究不仅发现epsH缺失株在斑马鱼感染中表现出更强的抗生素耐受性，更意外揭示了生物膜保护作用与细菌生长速率的精妙平衡关系，为开发靶向生物膜基质的结核病辅助疗法提供了重要理论依据。

研究团队运用三大关键技术：1）基于MycoMarT7转座子的全基因组突变库构建与表型筛选；2）结合AccuBlue荧光染色与qPCR-crosslinker的eDNA定量技术；3）建立成人斑马鱼结核感染模型进行体内药效评估。通过多组学分析和显微成像技术，系统解析了突变株的ECM组成变化。

Transposon library screen identifies high eDNA and low eDNA mutants in M. marinum biofilms
通过转座子突变库筛选，研究人员从1,939个突变株中鉴定出39个eDNA水平异常克隆。其中A6E7突变株的eDNA含量较野生型(WT)提高3倍，经测序证实其转座子插入epsH基因（编码预测的糖基转移酶）。

A mutant lacking a putative glycosyltransferase epsH has the highest level of eDNA under biofilm-forming conditions
生物信息学分析显示，M. marinum的EpsH与结核分枝杆菌Rv2957（PGL/p-HBAD生物合成糖基转移酶）结构高度相似。AlphaFold预测的结构重叠证实二者具有保守的催化域。

Complementation of the DepsH strain reverses the high eDNA phenotype
回补实验证实epsH缺失直接导致表型变化：回补株的eDNA水平恢复至WT水平（p<0.01），且qPCR显示epsH表达量恢复正常。

The deletion of epsH leads to an increased growth rate in biofilm culturing conditions
生长曲线分析揭示突变株在生物膜条件下的代时显著缩短（p=0.0009），但在浮游生长中无差异，表明EpsH特异性调控生物膜环境中的增殖。

The deletion of epsH increases the abundance of ECM under biofilm-forming conditions
定量分析显示突变株生物膜生物量/CFU比值较WT提高2-4倍（p<0.0001）。共聚焦显微镜观察到突变株形成更厚的（增加100%）且结构致密的绳状聚集体。

eDNA and extracellular proteins are increased in epsH-deficient biofilms
ECM组分定量发现突变株的eDNA和胞外蛋白分别增加3.5倍和3倍（p=0.0064），但刚果红染色显示纤维素含量无显著变化，提示EpsH可能参与其他多糖（如PNAG）合成。

DepsH biofilms are less tolerant to antibiotics in vitro
体外时间-杀菌曲线显示，尽管ECM增加，突变株对利福平（400μg/ml）和多西环素（250μg/ml）的耐受性反而降低（p<0.001），可能与生长速率加快有关。

M. marinum lacking epsH does not show altered growth rate in the adult zebrafish model
斑马鱼感染实验显示突变株与WT的增殖动力学无差异（p=0.1242），但抗生素治疗期间突变株的细菌载量稳定，而WT显著下降。

The lack of epsH increases antibiotic tolerance of M. marinum in the adult zebrafish
关键发现是突变株在体内表现出更强的抗生素耐受性：经利福平+莫西沙星治疗4周后，突变株的曲线下面积(AUC)显著高于WT（p<0.0001），证实ECM增加在感染环境下提供更强保护。

这项研究首次阐明EpsH糖基转移酶通过双重机制调控分枝杆菌生物膜特性：一方面通过限制eDNA沉积控制ECM总量，另一方面影响细菌在生物膜环境中的增殖速率。尤为重要的是，研究发现ECM的保护效应存在"环境依赖性"——在标准体外条件下，生长速率优势可能掩盖ECM的保护作用；而在复杂的感染微环境中，增厚的ECM展现出显著的耐受性增强。

从转化医学角度看，该研究提出了三个重要启示：1）靶向EpsH可能通过干扰ECM组装增强现有抗生素疗效；2）DNase等基质降解酶或可作为结核病辅助治疗药物；3）体外生物膜模型需结合体内实验验证耐受性机制。研究者特别指出，由于DNase已获批用于囊性纤维化治疗，其用于结核病辅助治疗的临床转化具有可行性优势。

这项研究不仅为理解分枝杆菌生物膜形成提供了新的分子框架，更开辟了通过靶向ECM组分克服抗生素耐受性的新思路。未来研究可进一步探索EpsH的确切底物及其在PNAG合成中的作用，为开发精确干预策略奠定基础。随着结核病耐药问题日益严峻，这种"拆解防护罩"的治疗策略或将成为缩短疗程、提高治愈率的关键突破口。