新型多极端耐受性内溶素LysBT1的酶学特性与稳定机制：C端S层同源结构域的功能解析

这篇研究揭示了源自嗜热菌前噬菌体的新型内溶素LysBT1的多极端耐受特性，其独特的C端S层同源（SLH）结构域通过介导三聚化、细胞壁结合和局部酶浓度提升，显著增强了对革兰氏阳性/阴性菌的裂解能力。该酶在95°C和pH 4.0-11.0条件下保持高活性，且半胱氨酸残基（Cys）和Zn2+ 结合位点共同维持其热稳定性，为开发广谱抗菌剂提供了新策略。

　　

引言

抗生素滥用导致耐药菌株激增，噬菌体编码的内溶素（endolysins）因其靶向细菌必需肽聚糖的特性成为理想替代品。本研究聚焦嗜热菌Brevibacillus thermoruber WF146前噬菌体编码的新型内溶素LysBT1，其独特的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶（NALAA）结构域与C端S层同源（SLH）结构域的组合尚未见于已知内溶素。

结果

1. 前噬菌体PBT1编码的LysBT1结构特征
LysBT1属于Amidase_2家族，但序列相似性仅16%-29%。其SLH结构域与Bacillus anthracis的S层蛋白Sap相似性为13%-31%，含保守的TRAE基序和GIIxG基序。结构预测显示SLH可形成三叉纺锤状三聚体，类似S层蛋白的伪三聚体构象。

2. 极端环境稳定性
LysBT1在95°C孵育1小时后保留60%活性，pH 4.0-11.0和0.1-1 M NaCl条件下均稳定。EDTA通过移除非特异性金属离子增强其热稳定性，而高浓度（10 mM）会螯合催化Zn²⁺
导致失活。还原剂β-巯基乙醇（β-Me）通过保护Cys残基抑制氧化损伤，而H₂
O₂
加速热失活。

3. Cys残基的关键作用
7个Cys中除催化位点Cys156外，Cys65/Cys109/Cys110等通过疏水相互作用稳定结构。突变体C156S在95°C迅速降解，而C65S/C109S/C110S三突变体热稳定性显著降低，证实Cys网络的累积稳定效应。

4. SLH结构域的多功能机制
SLH介导LysBT1三聚化，并通过结合次级细胞壁多糖（SCWP）锚定菌体表面。GFP标记实验显示SLH可结合革兰氏阳性菌（如G. stearothermophilus）和阴性菌（如E. coli BL21）表面，但结合谱与裂解活性不完全重叠。EDTA通过破坏S层结构，使LysBT1可裂解原本耐受的Bacillus cereus。

5. 广谱抗菌活性
LysBT1与EDTA或柠檬酸联用可裂解E. coli和Acinetobacter baumannii。值得注意的是，5 mM柠檬酸使LysBT1对A. baumannii的杀菌效率超越传统溶菌酶（HEWL）。

讨论

LysBT1的EDTA抗性源于其高亲和力Zn²⁺
结合位点，而表面离子对（54个）和SLH介导的寡聚化共同维持多极端稳定性。与同类酶相比，其SLH结构域创新性地整合了细胞定位与酶稳定功能，为设计针对耐药菌的工程化内溶素提供了模板。

材料与方法

研究采用基因克隆、定点突变和AlphaFold结构预测，通过浊度降低法和荧光标记验证功能。嗜热菌培养于55°C LB培养基，抗菌实验采用标准稀释涂板法统计菌落形成单位（CFU）。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献支持结论）