产ESBLs/AmpC酶合并孔蛋白缺失或外排泵过表达的碳青霉烯非敏感肺炎克雷伯菌分子特征及耐药机制研究

这篇研究深入解析了非碳青霉烯酶产酶型碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）的多重耐药机制，揭示其通过超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）/AmpC酶协同孔蛋白（OmpK35/OmpK36）缺失及外排泵（acrAB-tolC等）过表达形成"酶-膜屏障-外排"三位一体耐药模式，为临床精准防控提供分子流行病学依据。

　　

ABSTRACT

研究聚焦碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）中非碳青霉烯酶产酶亚型的耐药机制。通过对30株ertapenem耐药菌株的分析，发现所有菌株均携带ESBLs和/或AmpC β-内酰胺酶基因。基因测序显示大多数菌株存在ompK35和ompK36基因突变或缺失，SDS-PAGE证实相应孔蛋白表达减少或缺失。qPCR检测显示部分菌株外排泵基因过表达，揭示ertapenem耐药是酶产生、孔蛋白缺失和外排泵过表达共同作用的结果。

INTRODUCTION

肺炎克雷伯菌（KP）作为医院感染重要病原体，其碳青霉烯耐药株（CRKP）的流行已成全球公共卫生危机。传统认知中碳青霉烯酶是主要耐药机制，但非碳青霉烯酶产酶型CRKP通过ESBLs/AmpC酶联合孔蛋白改变形成耐药的现象日益突出。ertapenem因其对孔蛋白变化高度敏感，成为监测这类耐药的关键指标。

MATERIALS AND METHODS

研究收集南宁地区4家三甲医院138株CRKP，经mCIM表型筛选和PCR验证后，最终纳入30株非碳青霉烯酶产酶株。采用微量肉汤稀释法测定MIC值，PCR检测β-内酰胺酶基因、外排泵基因及孔蛋白基因，qRT-PCR分析基因表达，并通过SDS-PAGE验证孔蛋白表达情况。

RESULTS

1. 临床特征：菌株主要来源于移植科（20%）和ICU（20%），痰液（36.66%）和尿液（23.33%）是主要标本来源。
2. 药敏谱：所有菌株对ertapenem呈耐药/中介，对亚胺培南和美罗培南耐药率分别为3.33%和10%，对多数β-内酰胺类抗生素耐药率>70%。
3. 耐药基因：100%携带ESBLs基因（TEM 90%，SHV 93.33%，CTX-M-15 60%），43.33%携带DHA2型AmpC基因。
4. 孔蛋白分析：86.7%菌株存在ompK35/ompK36异常，26.7%双孔蛋白缺失。SDS-PAGE显示ATCC13883在低渗透压下OmpK35表达增强。
5. 外排泵：acrA基因表达上调最显著（4.17±5.01倍），kdeA/ketM/kpnE检出率100%。

DISCUSSION

研究揭示ertapenem耐药的三重机制协同作用：

1. 酶屏障：ESBLs/AmpC酶构成基础耐药屏障，CTX-M-15是主导基因型。
2. 孔蛋白缺失：ompK36的Gly134缺失和ompK35的提前终止突变是主要遗传改变，双孔蛋白缺失株的ertapenem MIC值显著升高。
3. 外排泵调节：acrAB-tolC系统过表达可能通过减少药物蓄积增强耐药。

值得注意的是，33kDa异常蛋白的出现提示可能存在新型耐药相关膜蛋白。临床实践中，移植和ICU患者因免疫抑制状态和侵入性操作成为高风险人群，需加强分子监测。

CONCLUSION

该研究阐明非碳青霉烯酶产酶CRKP通过"β-内酰胺酶+孔蛋白缺失+外排泵激活"的复合机制获得ertapenem耐药性，其中双孔蛋白缺失表型与高水平耐药显著相关。建议临床采用整合基因组学与表型检测的策略，为精准用药和院感防控提供依据。未来需扩大样本量并通过蛋白质组学深入解析膜蛋白异常与耐药性的定量关系。