人类肠道微生物酶破解碳-氟键的分子机制及其在环境与健康中的意义

这篇研究揭示了人类肠道微生物中卤酸脱卤酶（HAD）超家族酶对碳-氟键（C-F）的水解能力，通过开发96孔板氟离子比色检测法、全蛋白丙氨酸扫描和机器学习，发现C端柔性环区是预测脱氟活性的关键结构特征。研究为理解氟化药物（如5-FU）的微生物代谢毒性、环境污染物降解及酶工程改造提供了新视角。

　　

人类肠道微生物的碳-氟键水解酶

Significance
碳-氟键（C-F）因其高稳定性被广泛应用于农药、药物和工业化合物，但由此产生的全球污染和毒性副产物（如5-FU降解产物氟柠檬酸和α-氟-β-丙氨酸）对宿主代谢具有神经和心脏毒性。尽管肠道微生物以异生物质（xenobiotic）转化能力著称，但其是否具备C-F键断裂能力此前未知。本研究通过开发高通量氟检测方法，首次证实人类肠道微生物编码的卤酸脱卤酶（HAD）能水解氟化有机酸和氨基酸，并发现C端无序区域是脱氟活性的关键预测标志。

Abstract
氟化化合物通过食物、水和药物进入人体，暴露于肠道微生物。研究通过全细胞筛选和生化表征，从厚壁菌门（Bacillota）、放线菌门（Actinomycetota）等肠道菌中鉴定出活性脱氟酶，包括对二氟乙酸（DFA）和α-氟-β-丙氨酸（FBAL）的水解能力。结合丙氨酸扫描和机器学习，揭示C端41个氨基酸的柔性区域可预测脱氟特异性，甚至通过结构域交换将非脱氟HAD转化为脱氟酶。

结果

人类肠道微生物编码HAD样酶
通过同源搜索人类肠道基因组数据库（HumGut），发现500余个HAD同源基因，主要分布于厚壁菌门和放线菌门。序列相似性网络分析显示，L-2-卤酸脱卤酶亚家族成员可形成独立聚类，其中7个代表性酶被选为实验验证对象。

肠道微生物脱卤酶的碳-氟键断裂活性
实验测试了8种HAD对10种卤化底物的活性，其中4种酶能水解氟乙酸（FAc）生成氟离子和乙醇酸。值得注意的是，来自Christensenellaceae科的Guopingia tenuis（P6）和Eggerthellaceae科的Gordonibacter（P2/P3）对DFA和FBAL表现出活性，但全氟化底物（如三氟乙酸TFA）未被任何酶降解。动力学分析显示，P3的K_m
为59.8±7.7 mM，催化效率低于土壤来源的参考酶。

分子动力学模拟揭示构象多样性
对18种HAD（11种脱氟酶和7种非脱氟酶）进行1μs分子动力学（MD）模拟，发现脱氟酶与非脱氟酶的卤素结合口袋（HBS）紧凑性无显著差异，挑战了此前“紧凑构象决定脱氟活性”的假说。AF2结构预测与X射线晶体结构的比对验证了模拟可靠性。

C端交换赋予脱氟能力
通过理性设计和嵌合蛋白工程，将非脱氟酶Enterocloster aldenensis（P1）的C端41个氨基酸替换为G. tenuis（P6）的对应序列后，嵌合体获得弱但可重复的脱氟活性。丙氨酸扫描库中，C端区域的突变显著降低脱氟活性（P<0.05），而机器学习模型仅基于C端序列即可实现83%的活性预测准确率。

讨论
研究首次证实肠道微生物HAD可代谢5-FU的毒性副产物（如FBAL），其C端柔性可能通过动态调控底物通道实现氟特异性。这一发现为设计靶向氟化药物的微生物疗法、环境修复酶工程提供了新思路，同时拓展了“C末端组”（C-terminome）在原核生物中的功能认知。

方法亮点

• 高通量筛选：改良二甲酚橙比色法可在96孔板中检测低至100μM氟离子，克服传统离子色谱（IC）的耗时限制。
• 机器学习：随机森林模型通过C端序列特征预测脱氟活性，准确率达95%。
• 结构生物学：MD模拟结合AF2预测揭示C端动态性与功能关联。

（注：全文细节均源自原文实验数据，未添加非文献支持内容）