粪肠球菌细胞壁水解酶MltG在维持细胞壁稳态及介导头孢菌素耐药中的关键作用

这篇研究揭示了粪肠球菌(Enterococcus faaealis)细胞壁水解酶MltG通过其LysM结构域（非依赖酶活性）维持细胞壁稳态的新机制。研究发现mltG缺失导致生长缺陷、细胞壁完整性丧失、肽聚糖(PG)合成减少，并激活IreK/CroRS信号系统，进而通过上调低反应性青霉素结合蛋白(Pbp4/PbpA)增强头孢菌素耐药性。该工作为理解革兰阳性菌固有耐药机制提供了新视角。

　　

MltG在粪肠球菌中的功能解析

MltG对新生肽聚糖的切割作用
研究通过体外实验证实粪肠球菌MltG能切割由Pbp1A合成的新生肽聚糖(PG)链。实验设计巧妙地将PG合成与水解步骤分开：先用Pbp1A和脂质II合成PG链，再加入野生型MltG或其催化突变体E342Q。SDS-PAGE分析显示，野生型MltG能将长链PG切割为小片段，而E342Q突变体丧失此活性，证明其催化活性依赖保守的谷氨酸残基(E342)。这与其它菌种MltG同源物的功能一致。

mltG缺失导致生长缺陷
构建染色体mltG缺失株(ΔmltG)发现：该菌株呈现延迟且缓慢的指数生长期，此表型可通过回补野生型MltG逆转。令人惊讶的是，催化失活的MltG E342Q同样能恢复野生型生长，暗示MltG的非酶功能（如LysM结构域）对生长至关重要。异源表达粪肠球菌近缘种屎肠球菌(E. faecium)的MltG能互补表型，而大肠杆菌(E. coli) MltG则不能，说明LysM结构域的特异性功能具有种属特异性。

细胞壁完整性受损的连锁反应
通过CPRG水解实验发现ΔmltG菌株细胞壁通透性显著增加。磷酸化蛋白印迹显示，ΔmltG在无外界压力下即激活IreK（丝氨酸/苏氨酸激酶）和CroR（双组分系统响应调节因子）的磷酸化。值得注意的是，MltG E342Q也能抑制这种异常激活，再次表明酶活性非必需。Bocillin-FL标记实验揭示ΔmltG中PbpA和Pbp4表达上调，这与CroR调控网络相符。同位素标记实验进一步证实ΔmltG的PG合成速率降低约50%。

耐药性增强的双重机制
ΔmltG对头孢曲松的MIC值升高8倍（64→512 μg/mL）。通过药理学抑制IreK（使用星形孢菌素）或构建croR条件敲除株，证明这种超耐药性依赖IreK/CroRS信号系统。关键发现是：虽然MltG E342Q能纠正ΔmltG的生长缺陷，却维持了高耐药性，提示酶活性缺失本身即可促进耐药。结构域分析显示，缺失YceG催化结构域的突变体(ΔYceG)表型类似E342Q，而缺失LysM结构域(ΔLysM)则完全丧失功能互补能力。

理论模型与医学意义
研究提出创新模型：MltG通过LysM结构域（非酶活性）维持PG稳态，而YceG结构域的酶活性则负调控PBPs的转肽酶活性。当MltG酶活受抑时，低反应性PBPs（如Pbp4）活性增强，促进头孢菌素耐药。这一发现解释了粪肠球菌在医院环境中持续存在的部分机制——其通过精细调控PG代谢酶活性，在抗生素压力下获得生存优势。研究为开发针对MltG-PBP相互作用界面的新型抗菌剂提供了潜在靶点。

技术亮点
研究整合了多种前沿技术：

1. 建立体外PG合成-切割双阶段实验系统
2. 采用phos-tag SDS-PAGE动态监测信号通路激活
3. 开发基于CPRG水解的细胞壁完整性定量检测
4. 创新性使用Bocillin-FL活细胞标记PBPs

这些方法为研究革兰阳性菌细胞壁代谢提供了范式。未来研究可深入解析MltG LysM结构域与PG链的精确相互作用模式，以及其如何影响PBP的构象变化。