禾谷镰刀菌营养菌丝中RNAi机制介导的DNA甲基化在抗真菌病毒防御中的关键作用

本研究揭示了禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)通过RNA干扰(RNAi)机制介导的DNA甲基化在抗真菌病毒FgGMTV1防御中的新机制。研究人员发现病毒DNA启动子区域的甲基化可抑制病毒复制关键基因Rep的表达，该过程依赖DNA甲基转移酶DIM2及RNAi核心组分DCL/AGO。该发现首次证实真菌中存在RNA指导的DNA甲基化(RdDM)通路，为理解真菌抗病毒防御机制提供了重要突破。

　　

在自然界中，真菌与病毒的军备竞赛从未停歇。禾谷镰刀菌作为小麦赤霉病的主要病原体，其体内潜伏着一种神秘的三组分单链DNA病毒FgGMTV1。这种病毒如同特洛伊木马，能悄无声息地感染真菌却不引发明显症状。然而，真菌宿主并非毫无防备——长期以来，科学界已知植物和动物通过DNA甲基化对抗病毒入侵，但真菌特别是其营养生长阶段是否存在类似防御机制，始终是个未解之谜。更令人困惑的是，尽管真菌拥有DNA甲基化系统和RNA干扰(RNAi)通路，这两大防御系统之间是否存在协同作用，一直是真菌病毒学领域的空白点。

中国农业科学院植物保护研究所的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表的研究成果，首次揭开了这个谜团。他们发现禾谷镰刀菌能通过RNAi机制引导病毒DNA甲基化，形成独特的抗病毒防御系统。这一发现不仅改写了真菌抗病毒理论，更为开发新型真菌病害防控策略提供了分子靶点。

研究人员采用多组学联用策略开展研究：通过亚硫酸氢盐测序绘制病毒基因组甲基化图谱；利用基因敲除技术构建dim2、dcl1/2和ago1/2突变体；建立基于FgGMTV1的病毒诱导基因沉默(VIGS)系统；结合Southern blot和qPCR定量病毒载量；采用sRNA测序分析病毒来源小RNA；通过双荧光报告系统验证启动子甲基化对基因表达的调控作用。

研究结果部分：

FgGMTV1基因组是DNA甲基化靶标
全基因组甲基化分析显示FgGMTV1三个组分DNA-A、DNA-B和DNA-C均存在甲基化修饰，其中启动子区域甲基化水平最高。DNA-C的MeC5片段甲基化程度达55.87%，且CpG、CHG和CHH三种序列上下文均被甲基化。特别值得注意的是，甲基化热点集中在调控Rep、p26和p9/p18表达的启动子区域，暗示甲基化可能参与病毒基因表达调控。

DNMT DIM2在FgGMTV1甲基化中起关键作用
病毒感染的菌株中dim2表达显著上调。通过构建dim2缺失突变体发现，DIM2缺失导致病毒DNA甲基化水平降低（如MeA2片段甲基化减少），同时病毒积累量增加2倍。回补实验证实DIM2直接参与病毒DNA甲基化过程。表型分析显示DIM2介导的甲基化系统能增强真菌对氧化应激（H₂
O₂
）和膜损伤剂（SDS）的抵抗能力。

DIM2介导的甲基化抑制FgGMTV1 Rep启动子转录活性
将Rep启动子（500 bp）与GFP报告基因融合，发现dim2缺失突变体中GFP表达显著增强。亚硫酸氢盐测序证实dim2缺失导致Rep启动子甲基化水平降低。当用FgGMTV1感染携带Rep启动子-GFP的菌株时，病毒诱导的启动子甲基化显著抑制GFP表达，该效应依赖DIM2。这些结果证明病毒启动子甲基化是其转录抑制的分子基础。

DCLs和AGOs参与FgGMTV1 DNA甲基化
RNAi核心组分DCL1/2和AGO1/2的表达在病毒感染后发生显著变化。基因敲除实验显示，dcl1/2和ago1/2双突变体中病毒载量增加超过10倍，甲基化水平显著降低（如MeA2片段）。值得注意的是，DCL2和AGO1在抗病毒防御中起主导作用，而AGO2主要参与有性生殖相关RNAi通路。突变体表型分析发现RNAi缺陷菌株对FgGMTV1感染更敏感，表现为菌丝生长缺陷、应激反应异常和致病力下降。

DCLs和AGOs参与RNAi指导的DNA甲基化通路
sRNA测序发现21-22 nt病毒来源小RNA(vsiRNA)在甲基化热点区域富集。通过构建靶向RP27启动子的VIGS载体p26-D4-RP27F/R，证实病毒小RNA能引导整合的外源启动子甲基化，导致GFP表达沉默。该过程需要DCL1/2和AGO1参与，但AGO2非必需，揭示了真菌中RNA指导DNA甲基化(RdDM)通路的核心组分。

这项研究得出三个重要结论：首先，禾谷镰刀菌营养菌丝中存在活跃的DNA甲基化系统，能特异性识别并甲基化病毒DNA；其次，首次在真菌中发现RNAi机制引导的DNA甲基化通路，由DCL2和AGO1介导病毒sRNA生成并指导DIM2靶向病毒基因组；最后，这种表观遗传防御系统通过抑制病毒关键基因（如Rep）表达来限制病毒复制。

该研究的理论意义在于：打破了真菌DNA甲基化仅与有性生殖相关的传统认知；建立了真菌与动植物在抗病毒表观遗传机制上的进化联系；提出了"RNAi-DNA甲基化"协同防御的新范式。在应用层面，研究开发的FgGMTV1 VIGS系统为真菌基因功能研究提供了新工具，而揭示的DIM2-DCL2-AGO1通路则为设计基于表观遗传调控的植物病害防控策略指明了方向。

特别值得注意的是，与植物经典的24 nt sRNA介导的RdDM不同，真菌中主要由21-22 nt vsiRNA执行引导功能，暗示不同真核生物可能演化出各具特色的表观遗传防御机制。此外，研究还发现除RNAi依赖途径外，真菌可能还存在其他DNA甲基化机制，这为后续研究留下了有趣的问题。正如通讯作者Lihua Guo团队指出的，这项发现只是揭开了真菌表观遗传病毒学的序幕，更多关于甲基化信号识别、效应分子招募等机制细节仍有待阐明。