免疫缺陷患者中长期SARS-CoV-2感染的宿主内遗传多样性模式与变异进化动力学研究

本研究针对免疫缺陷患者中长期SARS-CoV-2感染（chronic infections）的病毒进化难题，通过九例患者的纵向样本重复测序，开发了可区分测序误差与低频突变的分析框架。研究发现患者间存在显著异质性非同义分歧率（divN），其中P5患者出现与抗体逃逸相关的刺突蛋白突变（S:E484K等）连续固定现象，揭示了慢性感染可能作为关注变异株（VOCs）的潜在来源。该研究为理解病毒适应性进化机制提供了重要数据支持，发表于《Virus Evolution》。

　　

在全球COVID-19大流行中，SARS-CoV-2病毒通过不断变异产生具有传播优势的关注变异株（VOCs），其起源机制成为关键科学问题。免疫缺陷患者中长期感染（chronic infections）被推测可能是VOCs的"孵化器"，因为这些患者体内病毒持续复制数月甚至逾年，为积累关键突变提供了时间窗口。然而，现有研究对慢性感染中病毒宿主内进化（intra-host evolution）的动态模式和驱动因素缺乏系统认知，且临床样本测序误差严重干扰低频突变（iSNVs）的检测精度。

以色列特拉维夫大学等机构的研究团队在《Virus Evolution》发表的研究，通过对9例免疫缺陷患者（包括白血病、淋巴瘤等）开展纵向重复测序（longitudinal duplicate sequencing），建立严格的数据过滤流程，揭示了慢性感染中病毒遗传多样性（intra-host genetic diversity）的异质性模式。研究发现患者P5出现刺突蛋白（spike protein）抗体逃逸突变（S:E484K、S:F490L等）的连续固定，证实了慢性感染可驱动类似VOCs的适应性进化；同时发现多数患者未表现显著进化，表明VOCs产生可能是罕见事件。该研究为评估慢性感染的公共卫生风险提供了量化依据。

关键技术方法包括：1）对40个临床样本进行ARTIC扩增子测序（artic-sars-cov-2/v3.0.0/v4.1.0引物）并采用iVar变异检测；2）建立基于重复测序的突变过滤流程（频率>1%，覆盖度>100x）；3）开发广义线性模型（GLM）量化同义分歧率（divS=1.9×10^-6
突变/位点/天）和非同义分歧率（divN）；4）通过急性感染队列鉴定45个可疑测序误差位点；5）使用UShER系统排除重复感染。

【结果】

1. 测序误差校正揭示真实多样性
   通过比较单次与重复测序数据，发现循环阈值（Ct）>24时未校正样本存在虚假多样性（R²
   =0.31）。建立的双重复过滤流程消除了技术偏差，证实慢性感染样本的核苷酸多样性（π）显著高于急性感染（p<10^-6
   ）。

1. 突变动态的个体异质性
   患者P4在35天内未出现>20%频率突变，而患者N8在更短时间内出现多突变固定。P5患者显示S:E484K（频率f=0.47）与S:V483A（f=0.46）的克隆竞争，最终前者固定。N7患者检测到祖先序列回复突变，提示可能存在超感染（superinfection）。

1. 分歧率量化与选择信号
   GLM模型估计全队列同义分歧率divS为1.9×10^-6
   突变/位点/天（95%CI 1.4-2.4×10^-6
   ），接近体外实验值。患者特异性divN显示P5的divN/divS>>1，伴随S:Δ144等突变固定；而P4的divN接近零，反映选择压力的个体差异。

1. 选择性清除事件检测
   定义divN>2×divS为快速分歧区间，在P3、P5中检测到伴随刺突蛋白突变固定的选择事件。P5在治疗后出现S:F490L和S:Δ144连续固定，显示治疗压力驱动进化。

【结论与意义】
该研究通过创新性的误差校正方法，首次系统描绘了慢性SARS-CoV-2感染的宿主内进化全景。主要发现包括：1）验证慢性感染可产生类似VOCs的突变组合，但仅发生在少数患者（如P5）；2）建立divN/divS量化框架为评估选择压力提供新工具；3）揭示免疫抑制程度与治疗干预共同塑造进化轨迹。这些发现表明，虽然多数慢性感染不会产生传播性变异，但极少数病例可能成为"变异工厂"，在持续高感染率背景下仍需警惕此类风险。研究方法为未来监测免疫缺陷患者的病毒进化建立了金标准。