黄酮类化合物根皮素与槲皮素作为辣根过氧化物酶强效抑制剂的发现及其在氧化应激检测中的干扰机制

本研究揭示了黄酮类化合物根皮素(phloretin)和槲皮素(quercetin)作为辣根过氧化物酶(HRP)的新型强效抑制剂，通过Amplex UltraRed(AUR)等实验体系证实其可显著干扰HRP依赖的H2 O2 检测，其中槲皮素抑制作用达nM级。该发现为HRP相关实验设计提供关键质量控制参考，并警示在评估黄酮类抗氧化活性时需规避HRP依赖性检测方法。

　　

在生命科学研究中，辣根过氧化物酶(HRP)因其独特的氧化还原特性，已成为免疫印迹、ELISA和H₂
O₂
检测等实验的核心工具酶。然而，当研究人员试图评估黄酮类化合物的抗氧化功效时，一个潜在陷阱逐渐浮现——这些被广泛研究的"抗氧化明星分子"可能直接干扰检测系统本身。这一矛盾在近年来多项研究中若隐若现，但缺乏系统性论证。

加拿大研究团队在筛选线粒体水通道蛋白(AQP)抑制剂时，意外发现根皮素能完全阻断HRP介导的H₂
O₂
检测。这一偶然发现促使他们深入探究黄酮类化合物与HRP的相互作用机制。研究结果发表于《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects》，揭示了这类"抗氧化剂"鲜为人知的酶抑制特性。

研究采用Amplex UltraRed(AUR)荧光检测、免疫印迹和ELISA等HRP依赖性技术，结合线粒体功能实验，对比评估了根皮素和槲皮素对HRP活性的影响。实验体系涵盖分离的肝脏线粒体、Huh-7肝癌细胞和Mia-PaCa2胰腺癌细胞等多层次模型。

3.1 根皮素强烈抑制肝脏线粒体H₂
O₂
生成
初始实验显示，50μM根皮素即可完全阻断丙酮酸/苹果酸供能线粒体的H₂
O₂
信号，该效应在琥珀酸或二氢乳清酸底物体系中同样存在。值得注意的是，根皮素仅干扰HRP依赖性检测，对H₂
-DCFDA和DHE荧光检测无影响。

3.2 槲皮素是更强的HRP抑制剂
剂量效应实验揭示槲皮素的抑制效力比根皮素高三个数量级，nM浓度即可完全抑制AUR检测中的试卤灵(resorufin)荧光。这种差异在体外H₂
O₂
检测和细胞模型中均保持一致。

3.3 黄酮类干扰HRP依赖性检测技术
研究证实两种黄酮类化合物能显著影响免疫印迹和ELISA结果。这种干扰具有剂量依赖性，且与黄酮分子的羟基化模式密切相关，提示其可能通过竞争HRP活性中心发挥作用。

该研究首次系统论证了黄酮类化合物作为HRP抑制剂的"双刃剑"特性：一方面，这些发现解释了既往研究中黄酮类"抗氧化"数据矛盾的部分原因；另一方面，为HRP依赖性实验提供了新型阴性对照工具。更重要的是，研究强调在评估多酚类物质抗氧化活性时，必须谨慎选择非HRP依赖的检测方法，如直接测量GSH/GSSG比值或采用H₂
-DCFDA等荧光探针。

这项意外发现不仅解决了长期困扰氧化应激研究领域的技术难题，还为理解黄酮类化合物的复杂生物活性提供了新视角。研究团队特别指出，未来探究植物多酚的抗氧化机制时，需要建立更严谨的实验设计规范，以区分真实的生物学效应与检测系统干扰。这些见解对代谢性疾病、癌症等氧化应激相关领域的研究具有广泛的方法学指导意义。